| 研究課題/領域番号 |
17591945
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| 研究種目 |
基盤研究(C)
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| 配分区分 | 補助金 |
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| 応募区分 | 一般 |
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| 研究分野 |
機能系基礎歯科学
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| 研究機関 | 北海道医療大学 |
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研究代表者 |
田隈 泰信 北海道医療大学, 歯学部, 教授 (40095336)
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| 研究分担者 |
荒川 俊哉 北海道医療大学, 歯学部, 講師 (40306254)
岡山 三紀 北海道医療大学, 歯学部, 助教 (30382500)
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| 研究期間 (年度) |
2005 – 2006
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| キーワード | siRNA / 開口分泌 / SNAREタンパク質 / 唾液腺 / 遺伝子ノックダウン / SNAP-23 / dominant-negative変異体 |
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| 研究概要 |
唾液腺には多数のSNAREタンパク質が発現しているが、開口分泌にどのSNAREが直接関与しているか明らかではない。本研究では、唾液腺細胞を用いる研究の前段階として、トランスフェクション効率の高いHeLa細胞をモデル細胞として、HeLa細胞の構成的分泌におけるSNAP-23の役割を、(1)siRNAによる遣伝子ノックダウン、および(2)dominant-negative変異体の過剰発現、という異なる二つのアプローチを用いて研究した。
その結果、同様の構造と機能をもつSNAREタンパク質が存在しないSNAP-23の細胞レベルをsiRNAによって90%低下させても、SEAP活性を指標としたHeLa細胞の構成的分泌は全く影響されなかった。同様に、SNAP-23とsyntaxin-4のダブルノックダウンによってそれぞれのタンパク質のレベルが80-90%低下したにもかかわらず、SEAPの構成的分泌は抑制されなかった。その際、他のSNAREタンパク質が代償的に増加する現象は認められなかった。
次に、C端から8アミノ酸残基削除したSNAP-23のdominant-negative変異体の発現ベクターを構築し、これをHeLa細胞に過剰発現させ、分泌に対する影響を調べた。その結果、SEAPの分泌は全く抑制されなかったが、GFP標識したヒト成長ホルモンhGH-GFPを発現させ共焦点顕微鏡で観察したところ、hGH-GFPを含む分泌小胞が細胞の辺縁部でカバーグラスと接触する部位に蓄積する像が見られた。このような変化は、C端から49アミノ酸残基削除したコントロールベクターでは全く見られなかった。
これらの結果から、SNAP-23はHeLa細胞の構成的分泌に関与しているが、その役割は必須ではなく、他のSNAREタンパク質によって一部代償可能と考えられた。
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