| 研究概要 |
(方法)USACをサブコンフルエントになるまで培養し、Ngのanti-senseoligonucleotideを導入後、13,7,14日目で、軟骨細胞分化マーカーであるSox9、Type II collagen(Col II)、Aggrecan(AG)、Type I X collagen、骨芽細胞分化マーカーである、Cbfal、Type I collagen(Col I)、Osteocalcin(OC)のmRNAの発現変化についてRT-PCR法で検討した。また、同様に処理した細胞を用いて、Col II、Cbfal、OCについてウエスタンブロット法を行った。さらに、組織学的に解析するためにBMP-2コーティングを施したニトロセルロース膜で作成したデイフージョンチャンバー内にUSACを培養して、それをヌードマウスの腹腔内に移植して骨軟骨組織形成をさせて、Toluizin Blue染色、Col II、BMP-2、Cbfal、OCの免疫染色を行った。また、同様の培養条件で、骨や軟骨の分化に関与すると考えられている内因性のBMP-2およびBMP-4の発現変化を解析するためにウエスタンブロット法を行った。続いて、USACをサブコンフルエントになるまで培養しNgタンパク添加後、同様の方法および条件で、RT-PCR法、ウエスタンブロット法、Toluizin bulue染色、免疫染色を行った。
(結果)Ngのanti-senseを導入したUSACにおいて、骨芽細胞分化マーカーである、Cbfal、Col IおよびOCのmRNA発現は増強されたが、軟骨細胞分化マーカーである、Col II、AG、Sox9のmRNA発現は減弱していた。Col XのmRNAについては早期に発現が上昇した。ウエスタンブロット法および免疫染色におけるタンパク質の発現においては、Cbfa1、OCが増強したが、Col IIは減弱していた。また、BMP-2の発現はNganti-sense導入によりその発現が増強していたがBMP-4に関しては、その発現が減弱していた。逆に、Ngタンパク添加時は、軟骨細胞分化マーカーの発現は増強していたが、骨芽細胞分化マーカーの発現は減弱していた。さらに、Ngタンパク添加によりBMP-2の発現は減弱し、BMP-4の発現は増強していた。また、Nogginの発現は、主としてBMP-2の濃度勾配と反してチャンバー内側の未分化な細胞に発現していた。
(考察)Ngを抑制することにより、骨芽細胞への分化が促進され、軟骨細胞への分化が抑制された。逆に、Ngタンパクを添加することにより軟骨細胞への分化が促進され、骨芽細胞への分化は抑制された。これは、Ngを抑制することにより内因性BMP-2の発現が増強されたため、骨芽細胞への分化が促進されと考えられた。また、Ngタンパク添加により内因性BMP4の発現が増強され、軟骨細胞への分化が促進された考えられた。
|
