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我々が発見した放射線抵抗性細菌デイノコッカス・ラジオデュランス由来の新規DNA修復促進タンパク質であるPprAタンパク質とDNAの相互作用の分子機構を解明するために、DNA結合能が欠失した変異体タンパク質を作製し、DNA結合能に必須なアミノ酸残基を同定すると共に、PprAタンパク質のDNA結合能、DNA修復に関する機能について生化学的解析を行った。具体的には、まず、DNAに対する変異原であるヒドロキシルアミンによる処理とerror-prone PCRによって、pprA遺伝子にランダム変異を導入し、DNA結合能が欠失した変異体タンパク質をスクリーニングした。次に、得られた変異プラスミドのDNA塩基配列を決定し、1塩基置換によるミスセンス変異あるいはナンセンス変異を持つプラスミドのみを選択した。さらに、変異遺伝子を大腸菌で発現させ、タンパク質祖抽出物とDNAを用いたアガロースゲルシフトにより、ゲルシフト状態に変化がみられる変異体をスクリーニングした。また、野生型PprAタンパク質とDNAの結合様式について、原子間力顕微鏡を用いて解析を行った。その結果、PprAタンパク質は2量体としてDNA断片の末端に結合することが明らかになった。次年度には、野生型及び今回選別した変異型の精製タンパク質を用いて、DNAとの結合能について詳細な検討を行う予定である。また、PprAタンパク質と蛍光標識したPprAタンパク質に対する抗体を用いて、哺乳動物細胞に起こったDNA鎖切断損傷を可視化検出する系を構築した。放射線照射線量に比例して、細胞中のDNA鎖切断損傷を反映すると考えられる蛍光強度の増大が観察された。この方法は、化学物質の遺伝毒性試験にも応用可能であると考えられた。
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