| 研究概要 |
本年度は,クラスター損傷内に含まれる損傷塩基数の直接定量を目的として,以下の研究を行った。
1.DNAの分離法の検討
クラスター塩基損傷を含むモデル基質を構築するため,1〜3個のウラシルを分子内に含むオリゴヌクレオチドを合成し,これをuracil-DNA glycosylaseで処理し,ウラシルを脱塩基部位(AP site)に変換した。これをaldehyde reactive probe(ARP)とインキュベートし,脱塩基部位をARPにより修飾した。ARP修飾したDNAを変性PAGEにより分離した結果,分子内の損傷数に応じてDNAが分離されることが示された。この結果から,クラスター損傷内に含まれる損傷数を,ARP修飾数として検出することができること明らかとなった。
2.クラスター塩基損傷に対するDNAグリコシラーゼの活性
thymine glycol(Tg)および8-oxoguanine(8-oxoG)は,放射線により生成する主要な酸化塩基損傷である。Tgあるいは8-oxoGをtop strandおよびbottom strandにそれぞれ1個ずつ含むクラスター基質(Tg/Tgクラスターおよび8-oxoG/8-oxoGクラスター)を構築し,DNAグリコシラーゼ(Endo IIIおよびFpg)による脱塩基部位への変換効率を調べた。その結果,損傷が1塩基以内にある場合は,脱塩基部位への変換効率が低下するが,3塩基以上離れている場合は,効率よく脱塩基部位に変換されることが明らかとなった。
以上のモデル基質の検討結果から,DNAグリコシラーゼ処理と生じた脱塩基部位のARP修飾を組み合わせることにより,クラスター損傷内の損傷塩基数を定量できることが示された。
|
