| 研究課題/領域番号 |
17651072
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| 研究機関 | 愛媛大学 |
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研究代表者 |
前山 一隆 愛媛大学, 医学部, 教授 (00157158)
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| 研究分担者 |
谷澤 克行 大阪大学, 産業科学研究所, 教授 (20133134)
小笠原 正人 愛媛大学, 医学部, 助教授 (00325367)
丹羽 修 産業技術総合研究所, 生物機能工学研究部門, 主任研究員 (70392644)
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| キーワード | アミンオキシダーゼ / ヒスタミン / マイクロセンサ / 基質チャネル / 酵素電極 / アンペロメトリー / トパキノ / カテコールアミン |
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| 研究概要 |
コリネ型土壌細菌の一種であるArthrobacter globiformis由来のヒスタミンオキシダーゼ(HAO)はトパキノンを補酵素とする銅含有酵素ファミリーの一つで、ヒスタミンを基質とする。我々はこれまでに本酵素を固定化し西洋ワサビペルオキシダーゼを含むオスミウムゲルを電子媒体として、電気化学的にヒスタミンを検出するヒスタミンセンサーを考案、実用化させてきた。酵素の基質特異性を利用しヒスタミンのみならずカテコールアミン、セロトニンに対するマルチプルアミンセンサの開発は各種脳内アミンの同時測定を可能とし、統合失調症、気分障害、摂食障害、睡眠-覚醒障害等の病態における研究に大いに寄与するものと考えている。
本年度はセンサの基礎となる酵素を人為的に改変し、基質特異性を変えた酵素を構築する目的でHAOの生化学的研究ならびに改変を試みた。HAOはすでにクローニングされ大腸菌により発現が可能となっており、さらに我々はHis-tag付のHAOを得ている。大腸菌から発現精製した本酵素を用いて以下の検討を行った。
1.ヒスタミン、メチルヒスタミンの測定系の開発:o-フタルアルデヒド,亜硫酸イオン存在下で上記アミンを反応させて、電気化学法により検出した(購入したHPLC用オートサンプラー(L-2200)を活用)。本法を用いてHAOの基質特異性を検討した結果、ヒスタミン、代謝物であるN^τ-メチルヒスタミン、生体内には存在しないN^π-メチルヒスタミンに対し活性比はそれぞれ100、75、117%であった。
2.本酵素の精製が容易となったことから、大腸菌から発現精製した本酵素の結晶化をすすめている。タンパク質立体構造解析によりアミンオキシダーゼの基質チャネルに相当するアミノ酸配列を明らかにし、部位特異的突然変異法を用いてヒスタミン以外の基質を選択的に触媒する酵素の改変を進めている。また愛媛大学総合科学研究支援センターに設置されている無細胞系タンパク質自動合成装置を用いて変異酵素の作成とスクリーニングを進めている。
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