| 研究課題/領域番号 |
17651113
|
|---|
| 研究機関 | 神戸大学 |
|---|
研究代表者 |
榎本 平 神戸大学, 人間発達環境学研究科, 教授 (00127622)
|
|---|
| 研究分担者 |
綾木 仁 広島文教女子大学, 人間科学部, 教授 (80222701)
|
|---|
| キーワード | 遺伝子クローニング / ブリッジヌクレオチド法 / oligo(dG)latex bead / cDNAクローニング法 |
|---|
| 研究概要 |
モデル実験系(blue or white colony形成plasmid)とシロイヌナズナcDNA libraryを用いた迅速クローニング法の高速化の検討
1)ブリッジヌクレオチド法で回収されたDNA plasmidの高温・再ハイブリによる回収効率上昇の再検討
昨年に、DNAの変性=1本鎖化の過程で物理的に1箇所以上切断されたターゲットcDNAを回収する方法をモデル実験系で開発したが、この切断された後に再構成・回収されたcDNAが元のcDNAと同じ塩基配列を示すのかどうか、DNAシークエンスを行うことで今回検証した。方法としてはモデルプラスミドpCYとpGBMのMCS部位の制限酵素切断部位を切断し、切断していないプラスミドと混合・変性・再構成し、大腸菌にトランスフェクトして、得られたクローンからプラスミドDNAを精製し、DNAシークエンスして比較した。その結果、調べた25回収クローンにおいてすべて切断部位の配列は、元のcDNAクローンと同一であることが明らかとなった。この結果により、切断再構成され、回収されたクローンも目的のターゲットクローンと同一であると推測された。
2)シロイヌナズナcDNA libraryからの光合成遺伝子Rubisco遺伝子のクローニングの試み
この方法の有効性を確かめるため、シロイヌナズナcDNA libraryから光合成過程の炭素固定に重要な遺伝子Rubisco cDNAの迅速クローニングを試みた。方法は、これまで通りのsuper-coiled cDNA plasmidをターゲットとする方法と、今回開発したBN回収・再構成法で得られたクローンをPCR法で確認し、比較した。結果は、super-coil/BN法に比べBN回収・再構成法は2-6倍のクローンをえることができた。
|
