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本研究は、外来遺伝子を搭載した組み換えポリオウイルスの増殖を指標にして、siRNAの効果を迅速かつ簡便に検出し定量化できる評価系を開発することを最終目標としている。昨年度は、ポリオウイルス遺伝子に対するRNA干渉効果を判定する条件について検討し、ポリオウイルス遺伝子に対するRNA干渉の程度には、ウイルス増殖の抑制と非常に密接な相関関係があること、ウイルス増殖の抑制は、細胞変性(死)の抑制として観察され、これは、RT-PCRによるRNAの定量や、特異抗体を用いた蛋白発現量の検出などの複雑な手順を経ることなく、顕微鏡による目視で検出することが可能であることを確認した。
本年度は、(1)T7RNAプロモーターの下流にポリオウイルスワクチンSabin1株を挿入し、カプシド遺伝子をGFP遺伝子に組換えてポリオウイルスベクター(PVB-GFP)を、(2)T7プロモーターの下でポリオウイルスカプシド蛋白質を発現するプラスミド(pcDNA-PV1)を作製し、T7RNAポリメラーゼを恒常的に発現するBHK細胞(BHK/T7-9)およびVero細胞(Vero/T7)を用いてGFP発現ポリオウイルス粒子の回収を試みた。BHK/T7-9細胞にPVB-GFPとpcDNA-PV1を導入すると、GFPの発現が認められた。この培養上清を回収し、pcDNA-PV1を導入してカプシド蛋白を発現させたVero/T7に接種したところGFPの蛍光が広がり、PVB-GFPとpcDNA-PV1からポリオウイルス粒子が産生されていることが確認できた。一方、カプシド蛋白を発現しないVero/T7細胞では、ウイルス粒子は産生されなかった。以上の結果、外来遺伝子を搭載し、カプシド蛋白の有無に依存して粒子形成が起こるポリオウイルスベクターが開発できた。今後は、T7RMAポリメラーゼ発現レベルの高いVero/T7を作製し、siRNAの評価系を構築することを目指す。
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