| 研究概要 |
キンギョソウ花弁中に発現しその花色発現を司るポリフェノールオキシダーゼは,花弁細胞中の液胞に存在することが明らかになっている.このポリフェノールオキシダーゼは銅を活性補因子として含んでおり,これまでの研究により,この酵素タンパク質への銅の取り込みには植物に特有なシャペロンタンパク質の関与が必須であることが強く示唆されていた.本研究においてはこの推定シャペロンタンパク質遺伝子を取得・同定するため,黄色キンギョソウ花弁からcDNAライブラリーを構築した.また,同植物の白色花弁からもcDNAライブラリーを構築した.次にこれらのライブラリーを用いて次の二つの戦略により推定シャペロン遺伝子の検索を行った. 1.PCR-Select subtraction kitを用いて黄色花弁cDNAライブラリーから白色花弁cDNAライプラリーを差し引くことにより,黄色花弁に特異的に発現しているcDNAを多数取得した.選抜された遺伝子群の発現が確かに黄色花弁特異的であることをノザンハイブリダイゼーションにより確認した.これらの遺伝子の塩基配列をCEQ Genetic analyzerにて解析し,それぞれの遺伝子の機能を推定している.また,機能が推定されたもので有力な候補遺伝子については,植物の器官別発現パターンや花弁細胞の生育ステージと発現パターンとの相関をノザンハイブリダイゼーションにより調査し,ポリフェノールオキシダーゼ遺伝子の発現と協調して発現しているものを探索している.
2.ポリフェノールオキシダーゼをbaitとして発現させる酵母Two-hybrid systemを用いて,ポリフェノールオキシダーゼと相互作用しうるタンパク質をコードする遺伝子を発現するクローンを,栄養要求性相補などの表現型を用いて選抜した.
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