|
前年度は、アミノ酸残基23〜95位、アミノ酸残基23〜100位、アミノ酸残基23〜105位の3種について、タンパク質を発現・精製し、これらがポリマー化することをMALDI-TOF質量分析で明らかにした。そこで、本年度はこうしたタンパク質がポリマー化する要因を解明するため、変異タンパク質の発現プラスミドを構築し、発現に成就した。現在、精製物について解析を実施している。
1 オクタペプチド構造のポリマー化の解析のための変異タンパク質発現プラスミドの構築
(1)オクタペプチドのリピート数増減発現プラスミドの構築
オクタペプチドのリピート数の多さがプリオン病発症年齢の早さ、感染の起きやすさに関連しているとの報告がある。これらがTrp/Hisのπ/πスタッキング相互作用による分子間多重体化の起こり易さ、安定度に相関している可能性があり、このため、リピート数を系統的に違えたプリオンタンパク質PrP(23-100)誘導体の発現プラスミド調製法の開発に取組んだ。リピート数1〜13までの発現プラスミドを作製し、発現・精製を行った。リピートの繰り返し13個のタンパク質は、発現するものの、精製過程で沈殿・凝集が起きやすくなることが判明した。他のものにつて現在、相互作用を解析中である。現在までに分析条件の設定に成就した。
(2)オクタペプチドのTrp→Ala変異プラスミドの構築
Trp/Hisのπ/πスタッキング相互作用による分子閻多重体化の起こり易さ、安定度に相関しているかを検討するために、リピート中のTrpをAlaに変異させた発現プラスミドを構築した。Trp→Ala変異体については、リピート数も1から5まで変化させたプラスミドの構築に成就した。これらは野生型の揚合と同じ方法で発現・精製が可能であった。現在、相互作用を解析中である。
2 オクタペプチドリピート構造の感染性異常型プリオン発現抑制の検討
恒常的に感染性の異常型プリオンを発現する細胞株が樹立されている。動物衛生研究所より、マウス神経芽細胞のスクレイjピー持続感染株N2a58-Scの分与を受け、これに対する発現タンパク質の影響をみる試験系の構築を行い、これに成就した。
|
