生体反応を利用した抗体の細胞内導入法の開発

2005 年度 実績報告書

• 研究課題/領域番号: 17658048
• 研究機関: 東京工業大学
• 研究代表者: 片岡 孝夫 東京工業大学, バイオ研究基盤支援総合センター, 助教授 (20242307)
• キーワード: ナチュラルキラー細胞 / パーフォリン / グランザイムB

研究概要

本研究では、細胞傷害性T細胞やナチュラルキラー細胞の細胞傷害機構を工学的に応用し、生細胞に抗体を効率的に導入する技術を確立することを目的とした。その第一段階として、実験材料となるパーフォリンとグランザイムB遺伝子の取得を行った。PCR3ベクター(Invitrogen,CMVプロモーター)を基本骨格として、マルチクローニングサイトの下流に、FLAGタグ(DYKDDDDK)を挿入し、C末端側にFLAGタグを付加することのできる動物細胞用発現ベクターを作製した。ヒトナチュラルキラー細胞株YTより、トータルRNAを精製した後、オリゴdTをプライマーとして、逆転写酵素反応を行い、一本鎖cDNAを合成した。パーフォリンおよびグランザイムBの塩基配列情報から、N末端およびC末端にそれぞれEcoRI、Xholの制限酵素配列を付加したプライマーを設計した。これらのプライマーを用いて、YT細胞より作製した一本鎖cDNAを鋳型としてPCRを行った結果、パーフォリンおよびグランザイムB遺伝子に相当すると考えられるDNAフラグメントを得た。これらのDNAフラグメントをEcoRIとXhoIで切断し、上記のC末端FLAG発現ベクターのEcoRI-XhoIサイトにクローニングした。DNAシークエンシングによって塩基配列を決定し、変異のないヒトパーフォリンおよびヒトグランザイムBの遺伝子であることを確認した。さらに、ヒト胎児性腎細胞HEK293細胞にパーフォリン遺伝子およびグランザイムB遺伝子を一過的に発現させ、細胞ライゼートを調製した。SDS-PAGEでタンパク質を分離し、ニトロセルロース膜へ転写後、抗FLAG抗体でウェスタンブロッティングを行った。パーフォリンおよびグランザイムBを発現させた細胞では、それぞれ60-70kD付近と30-35kD付近にポジティブなバンドが観察された。

研究成果

• [雑誌論文] Three new triterpenes from Nerium oleander and biological activity of the isolated compounds (2005)
  • 著者名/発表者名: Liwei Fu
  • 雑誌名: Journal of Natural Products 68(2) ページ: 198-206
• [雑誌論文] Acetoxycycloheximide (E-73) rapidly induces apoptosis mediated by the release of cytochrome c via activation of c-Jun N-terminal kinase (2005)
  • 著者名/発表者名: Kimiko Kadohara
  • 雑誌名: Biochemical Pharmacology 69 ページ: 551-600
• [雑誌論文] Cellular FLIP (long form) regulates CD8^+ T cell activation through caspase-8-dependent NF-κB activation (2005)
  • 著者名/発表者名: Austin Dohrman
  • 雑誌名: Journal of Immunology 174(9) ページ: 5270-5278
• [雑誌論文] The caspase-8 modulator c-FLIP (2005)
  • 著者名/発表者名: Takao Kataoka
  • 雑誌名: Critical Reviews in Immunology 25(1) ページ: 31-38
• [雑誌論文] RKTS-33, an epoxycyclohexenone derivative that specifically inhibits Fas ligand-dependent apoptosis in CTL-mediated cytotoxicity (2005)
  • 著者名/発表者名: Tomokazu Mitsui
  • 雑誌名: Bioscience, Biotechnology, and Biochemistry 69(10) ページ: 1923-1928
• [雑誌論文] Bioactive tetrahydrofuran lignans from Peperomia dingygulensis (2005)
  • 著者名/発表者名: Jian-lin Wu
  • 雑誌名: Journal of Natural Products 68(11) ページ: 1656-1660