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パーフォリン(孔形成タンパク質)およびグランザイムB(セリンプロテアーゼ)を動物細胞に添加することによって、グランザイムBが細胞外からサイトソルへ移行し、プログラム細胞死を誘導することが報告されている。本研究では、FRET(fluorescent resonance electron transfer)法を用いて、グランザイムBの細胞外からサイトソルヘの移行を検出できる実験系の構築を目的とした。FRET法に用いる蛍光タンパク質として、シアン蛍光タンパク質(AmCyan)および赤色蛍光タンパク質(DsRed-Monomer)を選択した。転写因子であるFosファミリーやJunファミリーは、分子内にbZIP(basic-region leucine zipper)モチーフを有し、ヘテロ二量体を形成することができる。FosファミリーおよびJunファミリーからマウスc-Fosおよびマウスc-Junを選び、bZIPモチーフ(35アミノ酸残基)をPCRで増幅し、DsRed-MonomerのN末側にクローニングした。さらに、AmCyanのN末側にc-Fosおよびc-JunのbZIPモチーフを挿入した発現ベクターを構築した。グランザイムBは、サイトソルへ移行するとプログラム細胞死を誘導するため、プロテアーゼ活性中心のセリン残基をアラニン残基に置換(Ser195→Ala195)した不活性型グランザイムBを作製した。また、野生型および不活性型グランザィムBから、シグナル配列およびジペプチド配列を除去した欠失変異体をそれぞれ作製した。さらに、野生型グランザイムB、不活性型グランザイムB、並びに野生型と不活性型グランザイムBの欠失変異体(シグナル配列とジペプチド配列を除去)をc-Fos-DsRed-Monomerおよびc-Jun-DsRed-MonomerのN末側に挿入した発現ベクターを構築した。
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