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1.1細胞からのPCR
既にサブクローン間で多型を見出しているCytochrome bの5'隣接領域の配列に基づいて設計したプライマー及び直接PCR用試薬Extract-N-Amp^Rを用いて、多型が検出できる条件を検討した。実体顕微鏡下でマイクロピペットにより単離したA.tamarenseの細胞をそのまま抽出試薬に添加してもPCR産物が得られなかった。そこで1細胞ずつを1辺が約1mmのNylon membraneに収穫し、凍結させた後抽出試薬に添加したところ、40検体中11検体のPCR産物が電気泳動で明瞭なバンドを与えた。これらの塩基配列解析によりいずれもCytochrome bの5'隣接領域の配列と一致もしくは類似していることを確認した。
2.代謝阻害剤による毒生産及び細胞周期の制御条件
5-fluoro-2'-deoxyuridine (FUdR)添加系の条件を確立し、昨年度と同様の手法を用いて細胞周期と毒生産への影響とその可逆性を調べた。30μM以上では完全に増殖が抑制された。細胞周期と毒量を同時に解析するため、200μM FudRを含む培地中で7日間培養したところ、完全に増殖が抑制された状態で95%が4日目にS期に停止したことがわかった。細胞内毒量は2日後に約2倍まで上昇し、その後はほぼ一定であった。MC添加系ではS期停止後も細胞内毒量が増加しており、FudRが麻痺性貝毒生産に抑制的に作用したものと推定された。FUdR除去後は細胞内毒量が増加し、細胞密度も上昇したことから毒生産抑制作用及び増殖抑制作用ともに可逆的であることがわかった。
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