| 研究課題/領域番号 |
17658124
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| 研究機関 | 生理学研究所 |
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研究代表者 |
平林 真澄 生理学研究所, 行動・代謝分子解析センター, 助教授 (20353435)
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| 研究分担者 |
保地 眞一 信州大学, 繊維学部, 助教授 (10283243)
金子 涼輔 大阪大学, 大学院生命機能研究科, 研究員 (40390695)
高田 達之 滋賀医科大学, 動物生命科学研究センター, 助教授 (90206756)
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| キーワード | テロメレース / トランスジェニックラット / アトピー性皮膚炎 / TERT遺伝子 / CAGプロモーター |
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| 研究概要 |
TERT遺伝子の構築とトランスジェニック(Tg)ラットの作製:
ラットTERT遺伝子をクローニングするにあたり、ラット精巣よりTrizolによって調製した全RNAをもとにオリゴdTプライマーを用いて逆転写し、cDNAを得た。これを鋳型にしたPCRによりTERT遺伝子断片を増幅し、ベクターにクローニングした後、DNAシークエンサーによって配列を決定した。このcDNAクローンをCAGプロモーター制御下に挿入し、IRESを介してEGFPを強発現するCAG/TERT-IRES-EGFP(CAG/TiG)コンストラクトを作製した。本コンストラクトをSalIとXhoIで切り出し、全長8.5kbの直鎖状DNAを5ng/μlの濃度に調製してラット前核期卵に顕微注入したところ、計323個のDNA注入卵子に由来する49匹の産仔が得られた。離乳後の産仔の耳組織片からDNAを抽出してPCRに供した結果、4匹(雄1、雌3)がCAG/Tigをもつトランスジェニック(Tg)ラットであることがわかった。ファウンダーが雌だった3匹は全て不妊だったが、ファウンダーが雄の1匹からはG1個体が得られ、サザン解析によりこのTgラットへのCAG/TiGの導入コピー数は8コピー程度であることがわかった。rTERTの発現を調べたところ、大脳皮質および精巣においてmRNAへの転写がRT-PCRにより確認できた。またテロメア伸張活性を調べたところ、脾臓、精巣、胸腺で増加していたが、大脳皮質、心臓、肝臓、腎臓では変化は見られなかった。また、このTgラットは生後2週齢からアトピー性皮膚炎様の症状を呈し、肥厚した表皮へのリンパ球の浸潤と、好酸球・脂肪細胞の真皮への浸潤が認められた。
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