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1.研究目的
法医学的試料から、その試料の由来する個人の年齢を推定するマーカーに関する研究は内外においてほとんどなされていない。そこで、本研究は、ヒト尿のプロテオーム解析により見い出した若年者に特異的なフィブロネクチン断片(Ugl-Y)の検出・定量法を確立することにより、年齢推定に有用なマーカーを開発することを目的として計画した。
2.研究内容および結果
(1)モノクローナル抗体の作製-マウスにUg1-YのC末端ペプチド(CTTGTPRSDTVPSPR)を注射し、モノクローナル抗体を作製を行った。得られたハイブリドーマのうち、上清に含まれる抗体の力価が高いものをELISAによって選別し、この抗体を用いて免疫ブロット法による尿中Ug1-Yの検出を行った。選別した15個のクローンのほとんどはUg1-Yを認識したが、いずれも力価が低く市販の抗フィブロネクチン抗体より劣っていた。より高力価の抗体を得るためには、何種類かのペプチドの混合物を抗原として用いることにより改善されるものと考えられた。
(2)抗体結合ビーズによる血清からのUg1-Yの簡易精製法の開発-前年度までの成果により、Ug1-Yは、尿だけでなく血清中にも存在することが明らかとなった。血清試料は尿試料に比べて比較的入手が容易であり、汎用性も高いことから、血清からのUg1-Yの簡易精製法の開発を試みた。抗フィブロネクチン抗体を結合したビーズに、1mlの血清を添加して十分に反応させたのち洗浄し、SDSを含むbuffer中で加熱して解離させたものを分析すると、Ug1-Yのバンドが検出された。この方法により、Ug1-Y量の加齢による変化を血清を用いて解析することが可能となった。
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