| 研究概要 |
1)GnRHプロモーター作動性Adenovirus Vectorの作成、精製、力価測定
ラットGnRHプロモーターおよびPDE4D1 cDNAを発現させるアデノウイルスをClontec社のAdenoX Expression Systemを用いて作成し、精製後にHEK293細胞に段階希釈したウイルスを感染させて力価を測定した。コントロールとしてCNG A2 specific siRNAを発現させるアデノウイルスを同様に作成して用いた。
2)GnRH神経細胞における導入遺伝子の特異的発現の検討
作成したアデノウイルスの特異的発現を検討するために、まずGnRH分泌培養細胞であるGT1細胞に感染させ、PDE4D1およびCNG A2 specific siRNAの発現をPCR, Western blot,免疫染色で確認した。
3)蛍光カルシウム試薬によるCalucium Oscillationの観察
アデノウイルスに感染させたGT1細胞に蛍光カルシウムインジケーターであるFura2を用いてCalucium Oscillationを観察したところ、導入した遺伝子の作用によりCalucium Oscillationの減少が認められた。
4)GnRHパルスの観察
アデノウイルスに感染させたGT1細胞のGnRHパルスを還流実験により測定した。細胞外還流液を4分から6分間隔で採取してGnRHをEIA法により測定したところ、導入した遺伝子の作用によりパルス間隔の延長が認められた。
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