網膜幹細胞のニッチ環境の解析と多分化能を維持した状態での高効率の培養法の開発

2005 年度 実績報告書

• 研究課題/領域番号: 17659549
• 研究機関: 熊本大学
• 研究代表者: 谷原 秀信 熊本大学, 大学院医学薬学研究部, 教授 (60217148)
• 研究分担者: 福島 美紀子 熊本大学, 医学部附属病院, 講師 (10284770) ; 伊藤 康裕 熊本大学, 医学部附属病院, 助手 (70380996)
• キーワード: 幹細胞 / ニッチ / 自己複製 / 多分化能 / Wnt / FGF / 細胞外基質 / 高効率培養

研究概要

生体内における網膜幹細胞ニッチを検討するために胎生14日から生後10日マウスにBrdUを取り込ませ数ヵ月後に毛様体におけるBrdU陽性細胞を観察するBrdU希釈法を用いて網膜幹細胞の同定を試みた。この方法でBrdU陽性細胞が毛様体部に認められ、これらが網膜幹細胞であることが推測された。しかしnestinなどの未分化マーカーと共陽性にはならず、SSEA-1などの表面抗原も同定するに至らなかった。したがって幹細胞を維持するニッチの環境の詳細は不明であったが、ニッチによる高効率培養のモデルとして液性因子と細胞外基質を検索し、自己複製・多分化能の検証を行った。過去の報告にしたがってマウス毛様体由来の成体網膜幹細胞をスフェア法によって単離し、得られたスフェアを分散して単層培養を行った。Wnt3a(R&D)を培地に添加することで細胞増殖マーカーであるKi-67陽性細胞は約4倍に、BrdUの取り込み率も約2倍になった。さらにFGF2(R&D)を同時に添加することでKi-67陽性細胞は約7倍となり、高効率な培養を確立できた。この細胞の未分化性を確かめるために単層培養の細胞を継代し再度スフェア法によって培養したところ、一部の細胞は2次スフェアまで形成可能であり、未分化性が維持されていることが示唆された。細胞外基質としての培養皿のコーティングについてはフィブロネクチンとオルニチンによってコーティングしたものが適当であった。また単離した網膜幹細胞を分化誘導条件下で培養したところ、複数の網膜細胞マーカーを発現する細胞が出現したことから多分化能を維持していることが確認された。分化誘導のための細胞外基質としてはラミニンによってコーティングされた培養皿を用いることで効率よく分化を誘導できた。本研究の結果、ニッチのモデルとしての液性因子と細胞外基質を同定し、網膜幹細胞の高効率培養を確立することができた。

研究成果

• [雑誌論文] Activation of canonical wnt pathway promotes proliferation of retinal stem cells derived from adult mouse ciliary margin. (2006)
  • 著者名/発表者名: Inoue T, Kagawa T, Fukushima M, Shimizu T, Yoshinaga Y, Takada S, Tanihara H, Taga T
  • 雑誌名: Stem Cells 24 ページ: 95-104
• [雑誌論文] NMDA-induced Retinal injury is mediated by an endoplasmic reticulum stress- related protein, CHOP/ GADD153. (2006)
  • 著者名/発表者名: Awai M, Koga T, Inomata Y, Oyadomari S, Gotoh T, Mori M, Tanihara H
  • 雑誌名: Journal of Neurochemistry 96 ページ: 43-52
• [雑誌論文] Rho-associated protein kinase inhibitor, Y-27632, induces alterations in adhesion, contraction and motility in cultured human trabecular meshwork cell. (2006)
  • 著者名/発表者名: Koga T, Koga T, Awai M, Tsutsui J, Yue BYJT, Tanihara H.
  • 雑誌名: Experimental Eye Research 82 ページ: 362-370
• [雑誌論文] Lactoferrin Glu561Asp Facilitates Amyloid Formation in the Cornea. (2005)
  • 著者名/発表者名: Araki-Sasaki K, Ando Y, Nakamura M, Kitagawa K, Ikemizu S, Kawaji T, Yamashita T, Veda M, Hirano K, Yamada M, Matsumoto K, Kinoshita S, Tanihara H.
  • 雑誌名: British Journal of Ophthalmology 89 ページ: 684-688
• [雑誌論文] Transthyretin synthesis in rabbit ciliary pigment epithelium. (2005)
  • 著者名/発表者名: Kawaji T, Ando Y, Nakamura M, Yamamoto K, Ando E, Takano A, Inomata Y, Hirata A, Tanihara H.
  • 雑誌名: Experimental Eye Research 81 ページ: 306-312
• [雑誌論文] Preferential differentiation of neural progenitor cells into the glial lineage through gp130 signaling in N-methyl-D-aspartate-treated retinas. (2005)
  • 著者名/発表者名: Mawatari Y, Fukushima M, Inoue T, Setoguchi T, Taga T, Tanihara H.
  • 雑誌名: Brain Research 1055 ページ: 7-14