| 研究概要 |
Phosphodiesterase(PDE)は細胞内のcAMPやcGMPを分解する酵素で,その濃度を調節する非常に重要な役割を担っている.現在,11種類(PDE1からPDE11)のファミリーに分類され,各ファミリーはアミノ酸配列相同性を示すサブファミリーがある場合がある.そこで、各PDEのサブファミリーの発現やPDE遺伝子異常を各口腔癌細胞で世界に先駆けて明らかにし,最近のナノテクノロジーやモレキュラバイオロジーの進歩と共に急速に発達してきたがん診断用DNAチップ等にPDEを加え,将来個人に最適なオーダーメイド治療への道を開く.本研究は細胞内シグナル伝達の側面から口腔癌を診断し,オーダーメイド治療へ向かおうとする全く新しい試みである.
口腔由来の悪性黒色腫細胞であるHMG, PMPやMAAなどで発現量が多いPDE2A, PDE3A, PDE3B, PDE4B, PDE4BとPDE5Aについて遺伝子異常を検討した.まず,各悪性腫瘍細胞よりトータルRNAを抽出し,電気泳動でトータルRNAの状態を確認した.RTでcDNAを合成後PCRで増幅し,電気泳動でPCR産物のサイズを確認した.PCR産物をTA cloningにてプラスミドベクターに導入した.ヒートショックにて大腸菌にプラスミドベクターをトランスフェクションし,寒天プレート上でコロニーを選択した.選択したコロニーをLB培地で培養し,プラスミドを精製した.目的のPDEが挿入されているのを制限酵素処理で確認後,濃度を測定した.シークエンスのためのPCRを行ない,シークエンサーでシークエンスを行った.今回行ったPDE2A, PDE3A, PDE3B, PDE4B, PDE4BとPDE5Aでは特に遺伝子異常は確認できなかった.そこで,今回シークエンスを行ったPDE以外のPDEについても同様に検討し,遺伝子異常の有無を確認する予定である.
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