RNAiを用いた顎口腔系の骨格筋量制御法の開発に関する研究

2005 年度 実績報告書

• 研究課題/領域番号: 17659648
• 研究機関: 徳島大学
• 研究代表者: 森山 啓司 徳島大学, 大学院ヘルスバイオサイエンス研究部, 教授 (20262206)
• 研究分担者: 大庭 康雄 徳島大学, 大学院ヘルスバイオサイエンス研究部, 助教授 (40294706) ; 泰江 章博 徳島大学, 大学院ヘルスバイオサイエンス研究部, 助手 (80380046) ; 西 真寿美 徳島大学, 大学院ヘルスバイオサイエンス研究部, 助手 (50380035) ; 井澤 俊 徳島大学, 大学院ヘルスバイオサイエンス研究部, 助手 (30380017) ; 金子 和之 徳島大学, 医学部・歯学部附属病院, 助手 (40380026)
• キーワード: RNAi / 筋分化 / 発現抑制 / マイオスタチン遺伝子

研究概要

Myostatin ORFをコードするcDNAをpcDNA3.1-myc/his expression vectorの制限酵素サイトBamH I/Apa Iサイトで組み込み、Myostatin-myc/his発現ベクター(以下p-myostatin-his)を構築した。このP-myostatin-hisをSuperfect Transfection Reagent(QIAGEN)を用いてCOS-1細胞に一過性に強制発現させ、抗his抗体を用いたWestern blot法を行ったところ、約52kDaの目的タンパクの強い発現が確認された。これはmyostatin前駆体と考えられる。RNAiの効果を検索するために、myostatinに特異的な19bpの二本鎖RNA発現プラスミドpSilencer2.1-U6 neo-Myostatin(Ambion)をp-myostatin-hisとCOS-1細胞にco-transfectionし、抗his抗体を用いたWestern blot法を行った。その結果、control群(p-myostatin-his単独群、あるいはGFP遺伝子に対するsiRNAをco-transfectionした群)と比較し、明らかなmyostatin-hisの発現抑制効果が確認された。そこで、マウス筋芽細胞株C2C12細胞を用いてmyostatin-his恒常発現株を樹立し、同様にRNAiを行ったところ、特異的かつ効果的なmyostatin-hisの発現抑制が確認された。Myostatin-his恒常発現株はcontrol群と比較し、有為な細胞増殖能の低下を示したが、この現象はmyostatinに対するRNAiを行うことで回復し、増殖能はcontrol群と同レベルとなった。今後は樹立したmyostatin恒常発現株を用いて、筋芽細胞分化調節機構に対するRNAiの有効性を確認し、さらに、in vivoにおける作用を検討していく予定である。

研究成果

• [雑誌論文] MIP-1alpha utilizes both CCR1 and CCR5 to induce osteoclast formation and increase adhesion of myeloma cells to marrow stromal cells. (2005)
  • 著者名/発表者名: Oba Y
  • 雑誌名: Exp Hematol. 33巻3号 ページ: 272-278
• [雑誌論文] Identification of cis- element regulating expression of the mouse Fgf10 gene during inner ear development. (2005)
  • 著者名/発表者名: Ohuchi H
  • 雑誌名: Dev Dyn. 223巻1号 ページ: 177-187
• [雑誌論文] Malignant B-lymphoid cells with bone lesions express receptor activator of nuclear factor-kappaB ligand and vascular endothelial growth factor to enhance osteoclastogenesis. (2005)
  • 著者名/発表者名: Shibata H
  • 雑誌名: Clin Cancer Res. 11巻17号 ページ: 6109-6115
• [雑誌論文] Messenger RNA expression of periostin and Twist transiently decrease by occlusal hypofunction in mouse periodontal ligament. (2005)
  • 著者名/発表者名: Afanador E
  • 雑誌名: Arch Oral Biol. 50巻12号 ページ: 1023-1031
• [雑誌論文] 線維芽細胞増殖因子受容体2(FGFR2) (2005)
  • 著者名/発表者名: 森山 啓司
  • 雑誌名: 生体の科学 56巻5号 ページ: 416-417