膜タンパク質の高効率立体構造解析をめざした発現系作成から結晶化までのシステム構築

2005 年度 実績報告書

• 研究課題/領域番号: 17681026
• 研究機関: 東京大学
• 研究代表者: 永田 宏次 東京大学, 大学院・農学生命科学研究科, 助教授 (30280788)
• キーワード: membrane protein / Thermus thermophilus / Aeropyrum pernix / high-throughput expression / structural genomics

研究概要

平成17年度は、原核生物の膜タンパク質を大腸菌を宿主として発現させる系について検討を行った。最初、グラム陰性細菌である大腸菌(Escherichia coli)、グラム陽性細菌である腸球菌(Enterococcus faecalis)、好熱真正細菌(グラム陰性)であるThermus thermophilus、好熱古細菌Aeropyrum pernixの4種の原核生物から膜タンパク質を選択する予定であったが、立体構造データベース(Protein Data Bank, PDB)の調査から、好熱菌由来の膜タンパク質の立体構造が数多く登録されていることが明らかになったため、好熱菌Thermus thermophilusとAeropyrum pernixの膜タンパク質を対象とすることにした。T.thermophilusのゲノム中1973個のORFから、SOSUIプログラムを用いて465個の膜タンパク質遺伝子を見出し、その後、推定膜貫通領域数3以上でかつ機能が解明または推定されているもの53個を選択した。同様に、A.pernixのゲノム中1841個のORFから、447個の膜タンパク質遺伝子を見出し、その中から53個を選択した。このようにして選択した計106個の膜タンパク質遺伝子は、受容体、輸送体、イオンチャネルまたはポンプとして機能すると解明・推測されている。これらの遺伝子を、当研究室でE.faecalisの7回膜貫通型膜タンパク質の高発現に利用しているpBAD(araBADプロモーター、Invitrogen)とpET-Mistic(T7プロモーター、枯草菌Bacillus subtilis由来の4回膜貫通型膜タンパク質Mistic(Roosild et al.,2005)との融合タンパク質発現ベクター、Novagen製品を改変)とに組み込み、現在、発現検定を進めている。

研究成果

• [雑誌論文] Crystal Structure Of the YjgF/YER057c/UK114 Family protein from the hyperthermophilic archaeon Sulfolobus tokodaii strain 7. (2006)
  • 著者名/発表者名: Miyakawa, T., (5名), Nagata, K., Tanokura, M.
  • 雑誌名: Proteins 62 ページ: 557-561
• [雑誌論文] Crystallization and preliminary X-ray analysis of PHI566, a putative ribosomal RNA processing factor from the hyperthermophilic archacon Pyrococcus horikoshii OT3. (2006)
  • 著者名/発表者名: Jia, M.Z., Ohtsuka, J., Lee, W.C., Nagata, K., Tanokura, M.
  • 雑誌名: Acta Crystallographica Section F : Structural Biology and Crystallization Communications 62 ページ: 47-48
• [雑誌論文] Crystal structure of monomeric sarcosine oxidase from Bacillus sp. NS-129 revcals multiple conformations at the active-site loop. (2005)
  • 著者名/発表者名: Nagata, K et al.(計11名)
  • 雑誌名: Proceedings of the Japan Academy, Ser.B 81 ページ: 220-224
• [雑誌論文] Crystal structure of the short-chain flavin reductase HpaC from Sulfolobus tokodaii strain 7. (2005)
  • 著者名/発表者名: Okai, M., Kudo, N., Nagata, K., Lee, W.C., Kamo, M., Tanokura, M.
  • 雑誌名: Proceedings of the Japan Academy, Ser.B 81 ページ: 229-232
• [雑誌論文] Crystallization and preliminary X-ray analysis of the YjgF/YER057c/UK114-family protein ST0811 from Sulfolobus tokodaii strain7. (2005)
  • 著者名/発表者名: Miyakawa, T.(5名), Nagata, K., Tanokura, M.
  • 雑誌名: Acta Crystallographica Section F : Structural Biology and Crystallization Communications 61 ページ: 828-830
• [雑誌論文] Crystal structure of glutamine amidotransferase from Pyrococcus horikoshii OT3. (2005)
  • 著者名/発表者名: Maruoka, S., Lee, W.C., Kamo, M., Kudo, N., Nagata, K., Tanokura, M.
  • 雑誌名: Proceedings of the Japan Academy, Ser.B 81 ページ: 459-462