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腫瘍壊死因子(TNFα)に類似性を持つプレセレブリン(Cbln1)は成熟小脳においてシナプス前部(顆粒細胞)から放出され、顆粒細胞-プルキンエ細胞のシナプス形態と機能(LTD誘導)を制御する、全く新しいタイプのシナプス栄養因子である。本研究は2年間の研究期間の間に
1)活性型・不活性型Cbln1分子の精製、2)受容体分子の同定、3)Cbln1のLTD誘導活性の解明の個別目標を達成し、Cbln1機能の分子機構を解明、成熟脳における神経栄養因子群の理解を飛躍的に深めることを目的としている。
本年度の研究成果
1)2)TNFαは、3量体を形成し、3量体構造を認識する受容体に結合することから、同じファミリーに属するCbln1分子も3量体形成が受容体結合、活性化に必須であると予想されていた。さらに、Cbln1N末端側のシステイン残基の存在はSS結合による更なる多量体化の可能性を示唆していた。実際、培養細胞に発現させたCbln1タンパク質は6量体を形成していることを明らかにした。この野生型Cbln1分子を哺乳類細胞系にて生成し、培養プルキンエ細胞、短期培養小脳スライス漂品に添加したところ、プルキンエ細胞樹状突起上の神経棘に特異的な結合が観察された。さらに3量体形成予想部位の変異Cbln1は細胞外に分泌されないこと。SS結合部位の変異Cbln1は、分泌はされるが、プルキンエ細胞への結合能を失うことを明らかにした。これらの結果は、シナプス前部である顆粒細胞から分泌された6量体Cbln1分子がシナプス栄養因子の実体であり、その受容体はシナプス後部であるプルキンエ細胞の神経棘に存在していることを示している。
3)Cbln1欠損マウスを用いてLTD誘導過程のどのステップに異常があるか検討した。プロテインキナーゼC活性化によるGluR2のリン酸化は正常、GluR2分子のエンドサイトーシス経路も正常であった。
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