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【目的】
真核生物におけるG→Cトランスバージョンのメカニズムを解明するため、Izの変異能を明らかにする。
【内容】
損傷入りのオリゴマーDNAの作製
8meoGを1ケ所入れた30merををリボフラビン存在下366nmの光で照射し、Iz入りの30merをHPLCで単離した。またOz入り30merはIz入り30merを熱分解によって得た。Gh入り30merは、80xoG入り30merにイリジウム酸化で処理し、HPLCで単離した。なお、全ての単離精製物は酵素分解による各ヌクレオシドの含有比の解析と分子量測定により同定を行った。HPLCは現研究室所有のものを使用した。MSとNMRは現大学中央機器室所有のものを使用した。
DNAポリメラーゼの調製
DNAポリメラーゼαを当初研究室で調整予定であったが、調査の結果、売られていたので、時間短縮のために購入した。また、異なる生物種のDNAポリメラーゼαを、別の研究者より提供を受けたので、これについても同時に使用した。
塩基取り込み・伸長反応の解析
損傷を16番目にいれた30merのDNAテンプレートとRIラベルした15merのDNAプライマーにデオキシヌクレオチド3リン酸を1種類加え、DNAポリメラーゼαにより取り込み反応を行い、その結果をポリアクリルアミドゲル電気泳動で解析した。伸長反応については、同様の実験系にデオキシヌクレオチド3リン酸4種類全てを用いて行った。挿入した塩基についての忠実度を調べるため、酵素濃度やデオキシヌクレオチド3リン酸の濃度を変化させ、速度論的パラメータを求めた。また、損傷の隣のサイトの効果を調べるため、同様に損傷DNAテンプレートを調製し、酵素反応を行った。RI施設は現大学RI施設を使用した。
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