|
超好熱性古細菌Thermococcus sp.strain KS-1のシャペロニンは、分子量約6万のαβの2種類のサブユニットから構成されている。これらのサブユニットは、約80%の高い相同性を有するが、αは、低温適応型、βは高温適応型という、サブユニット間で機能的な相違がある。しかしながら、高い相同性にも関わらずサブユニット間で熱安定性が異なる原因は不明である。本研究では、シャペロニンサブユニット間の熱安定性の相違の原因を調べ、シャペロニンの熱安定化の分子機構を調べる。X線立体構造解析からシャペロニンサブユニットは3つのドメイン(赤道、中間、頂点)から構成されており、都合の良いことにN末端からC末端の順に赤道、中間、頂点、中間、赤道ドメインと分かれている。本年度は、熱安定性に関与する部位を同定するために、ドメインを交換した変異体を作製した。αβシャペロニンサブユニット遺伝子上のドメインの境目それぞれの部分に特異的な制限酵素切断部位を導入して、遺伝子上で制限酵素切断によりドメインが組み換えられるようにデザインした。変異体作製には、ストラタジーン社のQuickchangemutatgenesisキットを用いて変異を導入し、変異導入後、DNAシーケンスにより変異を確認後、遺伝子操作で、ドメイン部分の組み換えを行った。ドメイン交換変異体は、αβサブユニットそれぞれに対して、赤道ドメイン交換変異体、中間ドメイン交換変異体、頂点ドメイン交換変異体の3種類(合計6種類)を作製した。変異させた遺伝子をT7RNAポリメラーゼを用いた発現ベクターpET21aに導入して、大腸菌で発現させ精製した。現在、精製した変異体の熱安定性を解析中である。
|
