|
大腸菌細胞を用いたPCA(Protein fragment complementation assay)法は、細胞内における異なる2つの分子の相互作用を検出する方法として確立されつつある。動物培養細胞などの真核生物を用いた同手法についても報告があるが、大腸菌を用いた場合に比べて、コストや時間の面で不利となることが多い。そこで、本研究課題では生化学・分子生物学実験における真核生物のモデルとして汎用されている出芽酵母を用いたPCA法の確立を目指した。分子間相互作用の検出方法としてのPCA法を、標的分子のリガンドスクリーニングへ応用することを視野に実験を開始した。
計画1年目である本年度は、細胞内情報伝達系に関わる分子間の相互作用の検出をモデルケースとして、PCA法のプロトコル確立のための準備実験を重ねた。タンパク質相補性の指標には、ジヒドロ葉酸レダクターゼ(DHFR)を利用するため、DHFR遺伝子のクローニングとベクターの分子設計、構築を進めた。本PCA法では、DHFR分子を2つに分割してそれぞれのベクターに導入して、ターゲットとなる細胞内情報伝達分子と融合させるが、1つ目の細胞内情報伝達分子を含むプラスミドについては構築が終了し、2つ目の構築準備を引き続き行っている状況である。さらに、宿主となる酵母のDHFRは、大腸菌の場合に阻害剤として知られているトリメトプリムに対して影響を受けないことが報告されている。そこで、スルファニルアミドを添加することで、トリメトプリムの増殖阻害効果を向上させることを目指した。用いた出芽酵母では、モル比で1:80-1:100(トリメトプリム:スルファニルアミド)の濃度で培地に添加した場合、増殖が最も阻害されることが確認でき、PCAでのスクリーニング条件としての指標物質の最適濃度を決定した。
|
