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概日時計は地球上のほぼ全ての生物にみられる普遍的な生命現象であり、その分子基盤の解明は現代の生命科学分野における最重要課題のひとつである。本研究では、(1)概日時計の光リセット機構、および(2)中枢時計組織に特異的に機能遺伝子を発現させる転写メカニズムを明らかにするため、松果体を主な研究対象として以下の研究を行った。
1.松果体の光情報伝達系の解析:ニワトリ松果体における概日時計の光リセットはG_<11>型の三量体G蛋白質を介すると考えられるが、このG蛋白質を活性化する光受容分子の実体は不明である。本年度はこの光受容分子の候補であるメラノプシンを培養細胞HEK293Sにおいて強制発現させ、発色団11-cis-retinalとの再構成実験を行った。その結果、可視部に光感受性をもつ色素の生成を確認した。現在、抗体カラムを用いたメラノプシン大量精製系の確立を試みている。また、バキュロウィルス/昆虫細胞系を用いたG_<11>型三量体蛋白質(G_<α11β1γ2>の強制発現系を立ち上げた。一方、ゼブラフィッシュにおいて同定した新規オプシン遺伝子(valopb)の発現パターンを詳細に調べたところ、松果体の近傍組織を含む非常に限定した脳組織に発現していることがわかった。
2.遺伝学的アプローチによる、松果体特異的な遺伝子発現に関わる転写因子群の固定:新規シス因子PIPEを介した松果体特異的な転写メカニズムを解明するため、PIPE依存性の松果体GFP発現を示す遺伝子導入ゼブラフィッシュを作成し、GFPを指標にした突然変異体スクリーニングを行っている。本年度は、既にプレスクリーニングにより単離した変異体候補58系統(F1)に対して、次世代(F2)における再スクリーニングを行った。その結果、変異系統を5系統に絞り込むことができた。現在、ホモ接合体における表現型を探索中である。
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