| 研究概要 |
シャペロニン(CPN)はATP依存的に基質である変性タンパク質をリフォールディングする代表的なシャペロンである。一方プレフォルディン(PFD)は変性タンパク質を補足し、CPNへ受け渡すと考えられているが、詳細な機構は未解明である。本研究では基質タンパク質の受け渡し機構を、1分子イメージング技術などを用いて明らかにすることを目的としている。まず、観察に用いるCPNの検討を行ったところ、超好熱性古細菌Thermococcus sp.strain KS-1由来のCPNホモオリゴマー2種(α CPN,β CPN)に関して、Pyrococcus horikoshii OT3由来PFD(PhPFD)に対するα CPNの親和性がβ CPNより著しく小さいことが新たに分かった。これを利用してCPN-PFD間相互作用の解析を行った。
β CPNのHelical protrusion領域を欠損させるとPhPFDとの親和性が大きく減少した。この領域でα CPN,β CPNではアミノ酸残基の電荷が2箇所逆転しているのでα CPNの該当箇所をβ CPN型に置換した変異体α K250E/K256Eを構築し、PhPFDとの相互作用を解析した。同変異体はPhPFDとの親和性がβ CPNと同程度まで増したことから、この2残基周辺がPFD-CPN相互作用部位であることが示唆された。またPFDに捕捉された酸変性GFPがCPNに受け渡されてリフォールディングし、蛍光回復が始まるまでにラグが観察された。このラグは受け渡しを反映していると考えられ、フィッティングによる解析の結果、PhPFDとCPNの親和力と基質受け渡しに相関があることが示唆された。現在はFRETによる基質受け渡しの評価系の構築を行っており、得られた知見により1分子イメージング系の構築を行う。
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