| 研究概要 |
1、natural mRNAの翻訳
ミトコンドリアnatural mRNA(13種)のうち、ATP8,COII,ND4について翻訳を試みた。これまでのところ目的の産物を得ることはできておらず、以下に述べる項目について検討を進めている。
2、翻訳系の改善
(1)ミトコンドリア抽出液の調製方法の改善
確立したミトコンドリア抽出液調製方法では、ロット間における翻訳活性の差が著しいという問題があった。そこで更に改善を加え、特に抽出時の界面活性剤とMg濃度を改善することで、安定した翻訳活性を示す抽出液を得られるようにした。ポリウリジン酸依存ポリフェニルアラニン合成系において、投入した全phe-tRNAの約2割がポリペプチドに取り込まれる。
(2)mRNAの設計
ミトコンドリアnatural mRNAを翻訳する際の問題点として、その2次構造やコドン使用頻度(大腸菌tRNAを用いて翻訳反応を行っているため)が考えられた。そこで、堅い2次構造をとらず、また大腸菌tRNAに適したコドンが使用されているテストmRNAを作製し、翻訳をこころみた。目的の翻訳産物は得られないものの、短い翻訳産物が生成していることが示唆された。翻訳反応条件の至適化により全長の目的産物を得ることができると考えており、検討を進めている。
まだ翻訳を試みていないミトコンドリアnatural mRNAの中で、ND6 mRNAは唯一大腸菌tRNAに適したコドンが使用されており、翻訳が期待される。
(3)添加因子の検討
ミトコンドリアnatural mRNAを大腸菌tRNAを用いて翻訳するにあたり、マイナーコドンに対応するtRNAを相補することが有効であると考えている。添加の効果について検証するため、マイナーコドンに対応するtRNAの大量調製を行った。
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