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Tdrd1/Mtr-1、Tdrd6、Tdrd7/TRAPは生殖細胞の分化過程で発現し、同蛋白質群は何れも生殖顆粒に局在する。本研究課題はこれらマウスtudor関連遺伝子群の機能解析を行い、哺乳類生殖顆粒構造が持つ機能の手掛かりを得る事を目的とする。本年度は下記実験を進めた。
1.Tdrd6、Tdrd7/TRAPノックアウトマウスの作成
Tdrd6、Tdrd7/TRAP遺伝子は複数のTudorドメインをコードし、特定のドメインの短い欠失では機能欠損を起こさない可能性が有る事から、loxP配列を含む相同組み換えベクターにより遺伝子領域全体に長い欠失を導入する必要がある。両遺伝子に関してBACシステムを利用した相同組み換えベクターを作成し、Tdrd7/TRAPに関しては組み換え体ES細胞株を得て、胚盤胞への導入、キメラマウスの作出を行った。Tdrd6に関しては組み換え体ES細胞株を得る事が困難であった事から、新たなベクターを作出してスクリーニングを進めている。
2.TDRD結合候補分子の探索
生体精巣に対する電気穿孔法を用いる事で、Tudorドメインが生殖顆粒の局在モジュールとして機能する一方、同ドメインの繰り返し構造が生理機能に必要である事を明らかにした。TDRD1/MTR1、TDRD6、TDRD7のTudorドメイン、tandem Tudorドメイン、MYNDドメインとGSTの融合蛋白質を発現、精製し、精巣の抽出液からのプルダウン実験を進め、蛋白質成分の電気泳動により特異的結合バンドの同定を行った。一方、哺乳類生殖顆粒のより包括的な解析を行う為、精巣からの細胞分取、細胞内構造分画、免疫沈降法によりTDRD複合体精製の詳細な条件検討を進めた。
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