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我々がクローニングした新規GRP78結合タンパク質は、組織レベルでの発現解析により、脳、特に胎児および生後の神経細胞に高発現し、加齢に伴って減少することが明らかになっている。この新規GRP78結合タンパク質は、膜貫通ドメインとproline-richドメインを有するものの、既知のタンパク質との相同領域を持たないことからその機能は依然不明である。そこで本研究では、新規GRP78結合タンパク質の機能解析の一端として、Two-hybrid法を用いて新たな結合因子の探索を行った。実験は、新規GRP78結合タンパク質を全長、N末端またはC末端を解析用ベクターに組み込み、各コンストラクトとマウス脳由来のcDNA libraryを元にしたスクリーニングを行った。その結果、GABA receptor associated protein like 1、cyclophilin Aが候補遺伝子として得た。そこで、Neuro2aまたはHEK293細胞に各々の遺伝子導入を行い、両者がGRP78結合タンパク質と会合するか否かを免疫沈降法にて解析した。その結果、両候補タンパクともに、既知の結合因子GRP78と比べると新規GRP78結合タンパク質に対してほとんど結合能を有しないことが明らかになった。今後、GRP78結合タンパク質-GST融合タンパク等も用いた別のスクリーニング法によって結合因子の探索を行う予定である。
また本年度は、種々の細胞系における新規GRP78結合タンパク質の発現とsiRNAによる内在性GRP78結合タンパク質ノックダウンについても検討した。その結果、siRNA処理後72時間以上にわたり新規GRP78結合タンパク質をノックダウンできる系を確立した。現在、siRNA処理ににより変動する遺伝子群をマイクロアレイ法によって解析中である。
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