| 研究概要 |
本研究は,当研究室において構築された遺伝子組換え技術を基に,安全性ならびに有効性,特に抗酸化能を有するアルブミン製剤を開発することを目的として企図された。まず,抗原性を考慮してヒト異常アルブミン(variant)に着目し,1残基置換variantの抗酸化能を評価した。
その結果、HSAの抗酸化能を担うアミノ酸残基として、^3His,^<122>Val,^<410>Arg及びドメインIIIの^<505>Gluが、HSA自身の構造及び機能を維持する上で必須残基として機能している可能性が強く示唆された。
そこで、yeast-E.coliのシャトルベクターpHIL-D2上でAOX1のプロモーター下流にシグナル配列とポリA配列を含むHSAcDNAを挿入した発現ベクターを作製し,Mutan-Super Express Km (Takara)を用いて部位特異的に変異させた後(^3His,^<122>Val,^<410>Arg及び^<505>GluをAlaに置換),このベクターでPichia pastoris(GS115株)を形質転換し,BMMY培地培養後,培地上清より60%硫安分画により濃縮を行い,Blue Sepharose CL-6Bを用い,アルブミンミュータントを精製した。
CDスペクトル法により,二次構造を検討した結果,いずれのミュータントにおいても血漿由来のアルブミン(pHSA)と類似した構造が観察された。また、この時の^<125>Iあるいは^<111>Inによりアルブミンミュータントをラベル化し,これらのラベル化アルブミンミュータントをラットに静脈内投与して血中半減期を調べ,pHSAのそれと比較した結果、^<410>Argのミュータントにおいてのみ、消失の促進が観察された。現在、これらミュータントの構造・機能特性について、詳細に検討中である。
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