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前年度までに選択、作成したオーファンGPCRとルシフェラーゼの融合タンパク質をコードするプラスミドについて細胞内における発現を検討した。BRETを用いたリガンド探索では動物細胞への一過性発現系を用いるため、これらのプラスミドを培養動物細胞へ一過性に遺伝子導入し、目的とする融合タンパク質の発現をルシフェラーゼ活性測定、フローサイトメトリーによって確認した。対象とするオーファンGPCRのうち数種は細胞内には発現しているものの、細胞膜表面への発現度が低かった。これらについては膜表面への発現を目的としたシグナルを付加する予定であるが、7回膜貫通型であってもGPCRでなくほかの機能をもつタンパク質である可能性もふまえて検討していく必要がある。また、細胞膜へ発現するものの、総発現量が極端に低いGPCRもあった。これらについてはルシフェラーゼのない状態で検討してもやはりタンパク質としての発現量が低いままであった。リアルタイムRT-PCRを用いて、mRNAレベルでの発現についても検討したところ、mRNA自体の発現量が低いことがわかった。どのオーファンGPCRもORFのみを用いてプラスミドを作成しているが、この低発現GPCRに関してはmRNAの安定性などをコントロールするために上流または下流の非翻訳領域も組み込む必要性を検討している。
リガンド候補としてはマウス脳から抽出したものの他に市販の脂質に各種の処理をしたものを用いることとし、現在準備をすすめている。
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