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造血幹細胞は高い再生活性を持つため白血病の治療に用いられているが、生体外で造血幹細胞を、その再生活性を保持させたまま維持する事は困難であり、特殊な分裂制御機構の存在が示唆される。これまでに申請者はNFREDは造血幹細胞で発現し、その分裂に必須であることを明らかにしてきた。本研究では造血幹細胞の分裂機構におけるNFREDの機能を解析する目的で、(1)NFREDによる遺伝子発現の調節機構の解明、(2)NFREDの可視化、(3)NFREDによる造血幹細胞分裂の誘導を目標にしている。
・β1インテグリン遺伝子のプロモーター内のNFRED応答領域の同定
ゲノムライブラリーからβ1インテグリン遺伝子のプロモーターを単離し、様々な遺伝子長のプロモーターをレポーター遺伝子の上流に組み換えたプラスミドを作成した。これらを造血幹細胞に遺伝子導入しプロモーター活性を測定した。その結果、約5kbp上流のプロモーター領域に転写活性があることを明らかとした。しかし、その活性は低く、さらに上流の領域が必要だと思われる。来年度はこの点を改善し、β1インテグリン遺伝子のプロモーター領域中のNFRED結合領域を同定する。
・NFRED遺伝子のプロモーターの同定
NFRED遺伝子のプロモーター領域はBACクローンから同定した。前述と同様にレポータープラスミドを作製し、ES細胞に遺伝子導入し、各々のプロモーター活性を測定した。その結果、約5kbp上流のプロモーター領域が幹細胞で特異的に転写活性がある事を明らかにした。
(3)NFREDの強制発現が造血幹細胞の自己複製に及ぼす影響の解析
NFREDとこれを安定化させるNFRED-binding protein 1を造血幹細胞に遺伝子導入したが、造血幹細胞の分裂能に差は見られなかった。遺伝導入効率が低いため、効果が検出されない可能性があるので、来年度は遺伝子導入方法を変えて再度試みる。
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