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(1)コンストラクトの作成
当初、ヒトグレリン遺伝子5'領域の解析(Endocrinology 2004.145:4144-)を参考に、マウスのプロモーター領域を単離、使用することを計画していたが、一からマウスのグレリン遺伝子5'領域の単離、解析を行うとなるとそれだけで非常な時間を要すること、また、これまでのトランスジェニックマウス作成の報告により、ヒトのプロモーター配列を用いた場合でも、ある程度、遺伝子発現の部位やタイミングを再現できることから、今回は時間短縮のため、すでに解析済みであるヒトのグレリン遺伝子5'領域をプロモーターとして用いた。細胞株における発現強度が、必ずしも生体内の発現を再現しているとは限らないため、培養細胞において最も活性が高かった上流約1.4kbの部位、また、これまでに検討した中で最も長い部位約4kbの二つのプロモーターを用いて、下流にSV40 T抗原を結合したコンストラクトをDNA組換えにより作製した。
(2)マウスの作成
マウス受精卵へ精製したコンストラクトの断片をマイクロインジェクションし、トランスジェニックマウスの作製を行った。1.4kbのプロモーターを用いたものでは、77、110、136、102、149、57個の遺伝子注入胚を仮親に6回に渡って移植したが、トランスジーン陽性マウスを得ることはできなかった。プロモーター活性が強すぎ、早期に死亡している可能性も考えられたが、詳細は不明であった。4kbのプロモーターを用いたコンストラクトでは、258、60、307個の胚移植を行い、計5匹のトランスジーン陽性マウスを得た。このうちの、3匹は、遺伝子発現が強すぎたためか、早期に死亡し、充分な解析を行うことはできなかった。また、もう一匹は不妊であり、交配を行っても産仔を得ることができなかった。残りの一匹については、交配に成功したため、来年度において解析に移る予定である。
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