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1.SAP145のRNA結合特異性を検証するため、組み換え蛋白質をHeLa細胞で発現し精製した。放射線ラベルしたESE-19・RNAに対する結合特異性をゲルシフト法で検討したところ、SAP145が1本鎖RNA特異的に結合することが明らかとなった。しかし、単一蛋白質での配列認識能力には限界があることも判明した。蛍光ラベルRNAを用いたUV-crosslink実験では、組み替え蛋白質よりも核抽出液からの粗精製分画の方が強い結合活性を持つことが示唆された。これらより、SAP145が複合体としてRNAと結合していると考え、これを実証するための実験の準備を行っている。
2.エクソン18・19・20及び周辺のイントロンからなる小型遺伝子をレポーターとし、HeLa細胞を用いてスプライシングの解析を行った。レポーター遺伝子のESE-19を部分破壊しESE活性を低下させると、約半数のmRNAでエクソン19のスキッピングが誘導された。このスキッピング現象はSAP145の過剰発現により相補(レスキュー)された。しかし、ESE-19を完全に除去すると、過剰発現でも相補できなかった。また、ESE-19の代わりにβグロビンのエクソン配列を挿入したエクソン19のスプライシングは、SAP145依存性を示さなかった。これらのことより、ジストロフィン遺伝子エクソン19の正しいスプライシングにはESE-19とSAP145の両者が必要であり、また、SAP145はESE-19特異的にエクソン使用を促進する因子であることが明らかとなった。治療で使用するオリゴDNAは、この二者の結合を阻害し、エクソンスキップを誘導しているものと推定される。
3.上記の小型遺伝子レポーター系は、一般的にスプライシングを調べる際にも使用可能であるため、汎用性を持たせる改良をプラスミドに施し、特許を申請した。
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