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(1)klotho遺伝子ノックアウトマスと野生型マウスとでNa-K ATPase活性に差異があるのか。
まず、両マウスの腎臓を用い、vanadate-facilitated[^3H]ouabain binding site content analysisにより、Na-K ATPaseの密度(含有量)が異なるかを検討したところ、実験毎にばらつきがあり確証が得られない状況である。これは、^<86>Rb摂取率によるNa-KATPase活性についても同様で、両マウス間で明らかな差異を認められていない。これは、Na-K ATPase遺伝子発現が、ノックアウトマウスの腎臓で優位に上昇しているのと様相を別にしている。しかし、klotho遺伝子発現細胞は腎臓皮質に限局し、一方、Na-K ATPase遺伝子発現細胞は、腎臓髄質および皮質でも見られるが、in situ hybridization法により、腎臓皮質においてのみ、両遺伝子発現細胞の一致が見られることを考えれば、腎皮質におけるNa-K ATPase機能こそがklotho遺伝子の影響下にあると考えられた。
そこで、両マウス腎臓から皮質のみを単離し、上述の方法により、Na-K ATPase活性を測定し結論を急いでいる。
(2)klotho遺伝子ノックアウトマウスと野生型マウスとでNa-K ATPaseを介するステロイドシグナルカスケードに違いがみられるか。
Na-K ATPaseがステロイドのsignal transducerとして機能する際、内因性のcardiac glycosideであるouabainからの入力シグナルが最たるものであり、膜型KLOTHO蛋白はNa-KATPaseと結合することでこのシグナルを制御していると考えられるが、今回、新たに、野生型マウス腎臓を用いたnorthern-blot法により、ouabain投与により、klotho遺伝子の有意の発現上昇が認められた。これより、klotho遺伝子ノックアウトマウスと野生型マウスとでは、ouabainに対する反応が異なり、これが表現型に寄与していることが予想され、ouabain投与後の両マウスから腎臓を摘出、さらに皮質を単離、これらよりmRNAを調整し、subtraction PCR hybridization法により、両者間で発現差異の著しい遺伝子群を見出している最中である。
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