| 研究概要 |
二量体化オピオイド受容体の脱感作に与える影響を一量体と比較検討し、各種オピオイドの二量体化オピオイド受容体に対する反応性の違いを検討を行った。このことによって各種オピオイドの効果的な使用方法、オピオイド耐性形成における二量体受容体の役割を分子生物学的に明らかにしていきたい。私達はこれまでに
(1)二量体化オピオイド受容体のみをアッセイするシステムの構築について以下の実験を行った。
(1)受容体局在化、ならびにFluorescence Resonance Energy Transfer (FRET)アッセイに利用クローン化μ受容体のC末端、ならびにクローン化δ受容体のC末端に蛍光波長の異なる蛍光蛋白(Yellow fluorescent protein (YFP), Cyan fluorescent protein (CFP))をそれぞれ連結させたものを作製した。さらにμ受容体のN末にT7-tag遺伝子、δ受容体のN末にFLAG-tag遺伝子を導入した。
(2)μ受容体、δ受容体にそれぞれ細胞内カルシウム動態をアッセイできるキメラ蛋白G_<qi5>を連結させた。
(3)これらの融合クローンをBaby Hamster Kidney (BHK) cellに発現させ
(1)(1)で作成したクローンを用いて受容体の細胞内局在を検討した。
免疫蛍光組織化学ならびに共焦点レーザによる受容体細胞内局在ならびにウェスタンブロットによる受容体二量体化の確認を行った。
(2)(2)で作成したクローンを用いて受容体刺激による細胞内カルシウム濃度上昇の可視化(カルシウムイメージング)を行った。
次年度は
(2)GRK4がμオピオイド受容体の脱感作に与える影響の解析
(1)μオピオイド受容体の細胞内局在の検討(共焦点レーザによる受容体細胞内局在の検討)
(2)FRETを用いたμオピオイド受容体・GRK4複合体化の検討
(3)さらにμオピオイド受容体-YFP-G_<qi5>という3連結蛋白を用いて(作成済み、Functionalであることも確認)μオピオイド受容体-YFP-G_<qi5>とGRK4-CFPとの蛋白-蛋白複合体化とμオピオイド受容体の機能との関連、特に受容体の脱感作について細胞内カルシウム濃度上昇を指標として解析を行う予定である。
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