| 研究概要 |
マウス精巣のcDNAライブラリから目的とするPLCζ遺伝子の全長を、既知のプライマーを用いたPCR法によりクローニングすることに成功したので、これをTOPOベクターにサブクローニングしておいた。
続いて蛍光蛋白との融合蛋白発現ベクターの構築に移行したが、できるだけ効率よく外来遺伝子を発現させるため、蛍光蛋白の末端にミトコンドリアへの移行シグナルを付けたEYFP-mitoベクターを用いた。このベクターを用いる際の遺伝子導入条件を設定するため、マウス精巣にエレクトロポレーション法によりEYFP-mitoベクターを導入して、EYFP蛋白の発現につき検討した。
5週齢のICRマウスを用いて、3μg/mlに調整したベクター溶液を精巣網から逆行性に注入した後に電気刺激を行い、一定の期間の後(20日,40日,60日)にEYFP蛋白の発現を観察した結果、マウス精巣内の精細胞に安定してEYFP蛋白が発現するための最適な条件は50V,50msec,8回の電気刺激であった。この条件下では精巣上体精子の中に、EYFP蛋白を発現する精子がおおよそ10%の割合で認められ、IVFに供するのに十分な数の精子が回収できるものと思われた。
そこでマウスPLCζ遺伝子をEYFP-mitoベクターにサブクローニングして、目的とするPLCζとEYFPとの融合蛋白が正しく発現されることを、大腸菌を用いて蛋白合成を行わせることで確認しておいた。
今後、このベクターを用いてPLCζとEYFPとの融合蛋白をマウス精子に発現させ、卵活性化のメカニズムの解析に利用する予定である。
|
