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Streptococcus mutansの産生する溶菌酵素Amlはう蝕原性細菌に対してのみ溶菌活性を有することから、う蝕予防剤になる可能性を持つ。そこで、Amlの基質特異性を明らかにするため、昨年度Amlの組換えタンパクを作製しその活性について検討を行ってきた。本年度においては結晶構造解析をするためのAmlの大量精製法の確立およびAml欠損変異株の作製を行い、性状解析を行った。
1)Amlタンパクの大量精製:His-tag融合Amlを用いて大腸菌を大量培養し、菌体破砕画分を用いてNi-NTAレジンにより粗精製を行った。得られた粗精製画分をphenylカラムによる高速液体クロマトグラフィーによりほぼ均一のタンパクバンドとして回収できた。現在、結晶構造解析に向け大量精製を行っている。
2)Amlタンパクの基質結合部位の組換えタンパクの作製・精製:1)の精製タンパクの回収効率が低いため、基質結合部位のみのHis-tag融合タンパクの作製を行った。また、大腸菌の系で精製を1)と同様の方法で行った。回収率も高く、均一のバンドとして精製できた。現在、結晶構造解析用に大量精製を行っている。
3)Amlの変異株を作製し、その性状について検討した所、菌体の分離が阻害され非常に長いレンサ状を呈することが観察された。また、この変異株にAmlを作用させることで長いレンサ状がほぼ単菌になった。また、親株にAmlを作用させた所レンサ状から単菌になった。したがって、Amlの生理作用としては菌の分離に関与していることが明らかになった。
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