| 研究概要 |
申請者はActinobacillus Actinomycetemcomitans由来のリコンビナントDnaKの精製を行っている。
1.A.a.のDnaKに対するプライマーを以下のように設計し,目的DNAをPCR法により増幅した。
5'-cca gat cta aat ggg aaa aat tgt tgg tat tga-3'
3'-cat taa cta aac aat cta tta ttg ttt ctt aag gc-5'
2.PCR産物を1.2%アガロースゲルで泳動しゲル切り出し法により目的DNAを得た。
3.目的DNAを制限酵素(EcoR(特)およびBg(監))にて処理し、DNA Ligation Kit(TKARA)を使いpRSET Aベクター(invitrogen)に組み込んだ。
4.作成したベクターを大腸菌(TOP10F')(invitrogen)に導入した。
5.形質転換した大腸菌を単離しプラスミドを精製し、目的DNAを確認した後BL21コンピテントセル(invitrogen)に導入した。
6.単離したコンピテントセルプラスミドを酵素処理し、アガロースゲルで泳動し目的の配列が組み込まれていることを確認した。
7.現在、IPTGでタンパク質の発現を誘導し、蛋白を精製する準備を行っている。
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