| 研究概要 |
CXC12架橋刺激によるβ1インテグリン活性のZAP-70役割を検討した.
ZAP-70mutantsのプラズミドpIRES2-EGFP Y292F、 Y315F、 Y493F ZAP・70を作製しP116細胞に発現させ,それぞれのタンパク質の発現をFACS(当大学所有)にて確認した.それぞれの細胞を用いてFibronectinへの細胞接着能をEACS(当大学所有)にて解析した。次にCXCL12架橋刺激による細胞内タンパク質のチロシンリン酸化状態の検討した.Jurkat細胞、 P 116細胞を抗体(Control,CD3)により刺激し,細胞を1%TritonX・100、 Protease inhibitor、 Phoshatase inhibitor存在下で可溶化しタンパク質分離泳動装置とパワーサプライ (当大学所有)を用いてSDSIPAGEで分離後ナイロン膜上に転写し、抗リン酸化抗体を用いたWestern blotting法により、細胞内タンパク質のチロシンリン酸化状態を検出した.CXCL12架橋刺激によるZAP・70結合細胞内シグナル伝達物質の同定をおこなった.可溶性タンパク質を抗ZAP・70、 SLP-76、 LAT抗体で免疫沈降を行い,Western blotting法によりLATとSLP-76リン酸化状態を検出した.以上の結果からT細胞におけるCXCL12刺激によるインテグリン活性化は,ZAP-70のY292、 Y315、 Y493、さらに、pIRES2・EGFP-delta LAT、 plRES2-EGFP・delta SLP・76発現させ,それぞれの細胞を用いてFibronectinへの細胞接着能をFACSにて解析した。以上の結果からZAP・70に下流に存在しインテグリン活性に影響を及ぼしたが、SLP-76に依存しない可能性が示された.
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