微量変異原評価を可能とする全ゲノム解読に基づく網羅的自然発生突然変異検出系の開発

2018 年度 実績報告書

• 研究課題/領域番号: 17H00789
• 研究機関: 東海大学
• 研究代表者: 権藤 洋一 東海大学, 医学部, 特任教授 (40225678)
• 研究分担者: 木村 穣 東海大学, 医学部, 教授 (10146706)
• 研究期間 (年度): 2017-04-01 – 2022-03-31
• キーワード: 自然発生突然変異 / ゲノム解析 / トランスクリプトーム解析 / ミュータジェネシス / 遺伝学 / 進化 / 次世代シーケンシング / バイオインフォーマティクス

研究実績の概要

自然変異を蓄積した完全遠縁交配8家系において、マウスゲノムの総ユニーク配列1,302,148,477bp上に発見した455個の新規SNV変異から自然変異率5.5X10-9/bp/世代を得た。受精時、どの接合子60億塩基対にも平均33個の新たなSNVが生じている計算になる。ヒトと同様に精子由来の変異が卵由来より２倍あるとすれば、精子から22個、卵から11個もたらされる計算となる。さらに、Amplicon-seqでトレースできた214SNVのうち56個(26.2%=56/214)が、変異アリル頻度(MAF)30％未満であった。Amplicon-seqリード数の平均値39,736および中央値25817より、ヘテロ接合体のMAFの期待値50％からは有意に減る方向へのみ変異アリル頻度が偏っていることを確認した。受精後2細胞胚期に変異が固定すればMAF25％、４細胞胚期に固定すれば12.5％と半減していくことから、発生初期32細胞胚期までに生殖細胞系列変異の26.2％が固定したという昨年度の仮説を裏付けた。また、雌性および雄性生殖細胞の初期発生時の分化および分裂数の違いを加味し、卵では平均30回、精子では平均70回の細胞分裂後に受精し世代交代が進むとすると、雌雄何れの生殖細胞系列においても32細胞胚期までは2.8X10-10/bp/細胞分裂、32細胞胚期以降は9.2X10-11/bp/細胞分裂と、胚発生初期は以降よりも３倍変異率が高いことを（2017年度報告を是正するとともに）世界ではじめて明らかにした。
マウス近交系の兄妹交配を用いた変異蓄積も予定通り進み、各世代から解析のための採材を行なった。
初期発生において変異率が高くなるメカニズム解明のために、マウス未受精卵の網羅的トランスクリプトーム解析が、先進ゲノム支援課題として採択され進んだ。情報解析のためサーバ室を新たに構築整備した。

現在までの達成度 (区分)

1: 当初の計画以上に進展している

理由

2018年度は、これまでまったく知られていなかったほ乳類ゲノムに生じる突然変異について「塩基対当たり細胞分裂当たり（＝DNA複製当たり）」の変異率を世界で初めて得たのがもっとも大きな成果となりさらに前倒しで研究が進んだ。次世代シーケンシングの利用により、ヒトやマウスなどでも「塩基対当たり世代当たり」の自然突然変異率の推定は進んでいるものの、「細胞分裂当たり」の突然変異率推定は放射線や化学変異原など頻度が高い状態でも推定することが困難であった。また、培養細胞系ですらなかなか推定ができなかった。本研究から、雌雄生殖細胞分化の起こっていない32細胞胚期以前では、平均2.8X10-10/bp/細胞分裂、また、32細胞胚期以降の雌雄分化が生じ成体まで平均9.2X10-11/bp/細胞分裂という自然変異率がはじめて得られた。ヒトなどですでに報告されている卵由来と精子由来の変異数の違いは、卵が胎児期の減数分裂期で分裂が休止状態となるのに対し、精子では生涯細胞分裂が続いていくことの違いで説明できることも明らかとした。
また、胚発生のごく初期に変異率が高いことによって、産仔数が極めて少ないほ乳裏や鳥類でも遺伝的多様性を高く保ちうる効果的な選択淘汰と適者生存が可能となる、という2017年度に提唱した作業仮説の検証にあたり、まず2018年度は、マウス未受精卵に「異なるDNA複製修復組換えなど関連酵素群のセット」が受精前に用意されていて細胞分裂ごとに半減し、順次、成体におけるセットに置き換わる、という仮説検証を開始した。そのために未受精卵約2000個を採取し、網羅的トランスクリプトーム解析が順調に進んだ。さまざまな遺伝的背景によって自然変異の起因や生成が異なるかどうか検証するためのマウス近交系を用いた兄妹交配も順調に進み採材を予定どおり実施しサンプルを凍結保存した。情報解析用のサーバ室整備も進んだ。

今後の研究の推進方策

予定より進んでいるので前倒しして変異解析を進めて行く。まず、2019年度からいよいよ遺伝的背景の異なる条件下での自然発生変異の違いの有無の実験検証に入る。そのために、兄妹交配から得たサンプルのゲノムDNAを抽出し全ゲノムシーケンシングを行なう。
また、32細胞胚期までの高頻度自然突然変異率の起因を明らかにするため、2018年度には先進ゲノム支援課題としても採択され、マウス未受精卵トランスクリプトーム解析が進んだので、2019年度は情報解析を進める。とくに、DNA複製修復組換えなど遺伝子群に着目して未受精卵固有の発現遺伝子や量の違いなどの情報解析を行なう。小さなindel変異検出は進んでいるので、2019年度は、500bp以上のいわゆる構造変異structural variationの検出のための情報解析にも着手する。
2018年度には新たにサーバ室を構築整備し、一連の情報解析に必要なリナックスサーバおよび基本となる情報解析パイプラインも拡充したので、チューニングを行いバイオインフォーマティクス解析にも本格的に取りかかる。
さらに、自然に生じる変異を高速高精度に検出できることを実証したので、微量変異原におけるLNTモデル検証などを、実際に進めるための共同研究など2019年度から本格的に検討する。
2017年度の成果を踏まえて、2018年度は国内学会や会議での招待講演依頼も多く引き受けた。2018年度に世界ではじめてえられた「ほ乳類の個体内に自然に生じる変異の塩基対当たり細胞分裂あたりの変異率」など、すでにいくつかさらに大きな成果が得られたので、2019年度からは国際会議での発表および原著論文発表も行い、情報公開をさらに推し進めていく。

備考

アウトリーチ活動：
「ゲノムの基本から個別化医療やデザイナーベイビーまで」神戸高校12回生東京会12月例会招待講演、2018年12月8日、神戸大学東京六甲クラブ、東京都千代田区
特別講義「ゲノム解析から個別化医療・デザイナーベイビーまで」2018年12月25日、東海大学医学部，伊勢原市

研究成果

• [国際共同研究] Medical Research Council (MRC)/Institute of Neurology(英国)
  • 国名: 英国
  • 外国機関名: Medical Research Council (MRC)/Institute of Neurology
• [国際共同研究] Hospital Universitario de Canarias(スペイン)
  • 国名: スペイン
  • 外国機関名: Hospital Universitario de Canarias
• [国際共同研究] The Jackson Laboratory/US Food and Drug Administration (FDA)(米国)
  • 国名: 米国
  • 外国機関名: The Jackson Laboratory/US Food and Drug Administration (FDA)
• [国際共同研究] Fudan University(中国)
  • 国名: 中国
  • 外国機関名: Fudan University
• [国際共同研究] KRIBB(韓国)
  • 国名: 韓国
  • 外国機関名: KRIBB
• [雑誌論文] Mice with endogenous TDP-43 mutations exhibit gain of splicing function and characteristics of amyotrophic lateral sclerosis. (2018)
  • 著者名/発表者名: Fratta P, Sivakumar P, Humphrey J, Lo K, Ricketts T, Oliveira H, Brito-Armas JM, Kalmar B, Ule A, Yu Y, Birsa N, Bodo C, Collins T, Conicella AE, Mejia Maza A, Marrero-Gagliardi A, Stewart M, Mianne J, Corrochano S, Emmett W, Codner G, Groves M, Fukumura R, Gondo Y, Lythgoe M,(15名略), Fisher EM, Acevedo-Arozena A
  • 雑誌名: EMBO Journal 巻: 37 ページ: e98684
  • DOI: 10.15252/embj.201798684
  • 査読あり / オープンアクセス / 国際共著
• [学会発表] 微量変異原評価を可能とする自然発生変異の高精度検出系の開発と現状 (2019)
  • 著者名/発表者名: 権藤洋一
  • 学会等名: 放射線影響研究のパラダイムシフト―ポストLNTモデルの構築検討会
  • 招待講演
• [学会発表] 全エクソーム解析による新規Crim1変異マウスの同定 (2018)
  • 著者名/発表者名: 古市達哉、塚本愛美、佐藤有里子、斎藤聖紀、福村龍太郎、権藤洋一
  • 学会等名: 第65回日本実験動物学会総会
• [学会発表] 個体発生における生殖細胞系列突然変異の起因とその分子機構仮説 (2018)
  • 著者名/発表者名: 権藤洋一
  • 学会等名: 第36回基礎医学系懇談会
  • 招待講演
• [学会発表] ゲノム時代における統計遺伝学と量的遺伝学 (2018)
  • 著者名/発表者名: 権藤洋一
  • 学会等名: 第12回生物学基礎論研究会
• [学会発表] マウスにおける自然突然変異のゲノムワイド解析 (2018)
  • 著者名/発表者名: 権藤洋一
  • 学会等名: 日本遺伝学会第90回大会
  • 招待講演
• [学会発表] 加齢依存的に繰り返し毛色を変化させるマウス変異体の表現型解析 (2018)
  • 著者名/発表者名: 松宮諒咲、嶺井隆平、瀧川和弥、福村龍太郎、権藤洋一、天野孝紀、澁谷仁寿、田村勝、若菜茂晴、城石俊彦、山本博章
  • 学会等名: 日本遺伝学会第90回大会
• [学会発表] マウスモデルに基づく胚発生の極初期に個体発がんドライバー変異が生じる可能性の示唆 (2018)
  • 著者名/発表者名: 権藤洋一、木村穣
  • 学会等名: 第77回日本癌学会学術総会
• [学会発表] 自然発生生殖細胞系列突然変異のほ乳類の発生段階における起源 (2018)
  • 著者名/発表者名: 権藤洋一、福村龍太郎、小瀧逸人、石塚祐一、中井祐治、牧野茂、森一樹、久原哲、豊田敦、藤山秋佐夫、木村穣
  • 学会等名: 日本人類遺伝学会第63回大会
• [学会発表] マウスに自然に生じる突然変異の網羅的解析から見えてきたほ乳類ゲノム多様性維持の戦略 (2018)
  • 著者名/発表者名: 権藤洋一
  • 学会等名: NAISTセミナー
  • 招待講演
• [学会発表] マウス生殖系列で発生するde novo変異から見る哺乳類ゲノムの進化 (2018)
  • 著者名/発表者名: 内村有邦、樋口真弓、水口洋平、松本拡高、若山清香、若山照彦、佐藤康成、福村龍太郎、辻隆弘、今中正明、中本芳子、三浦昭子、権藤洋一、豊田敦、八木健
  • 学会等名: 第41回日本分子生物学会年会
  • 招待講演
• [学会発表] マウス生殖細胞系列突然変異の起源とほ乳類における遺伝的多様性維持機構 (2018)
  • 著者名/発表者名: 権藤洋一
  • 学会等名: 第41回日本分子生物学会年会
  • 招待講演
• [学会発表] 毛周期依存的な毛色変化を示すマウス変異体の多面発現 (2018)
  • 著者名/発表者名: 瀧川和弥、松宮諒咲、嶺井隆平、田端裕正、福村龍太郎、権藤洋一、天野孝紀、澁谷仁寿、田村勝、城石俊彦、山本博章
  • 学会等名: 第41回日本分子生物学会年会
• [学会発表] ほ乳類など産仔数の少ない生物種における遺伝的多様性産出と適応放散戦略の検証 (2018)
  • 著者名/発表者名: 権藤洋一、福村龍太郎、小瀧逸人、石塚祐一、中井祐治、牧野茂、本杉奈美、木村穣、森一樹、久原哲、豊田敦、藤山秋佐夫
  • 学会等名: 先進ゲノム支援合同班会議
• [学会発表] 変異解析に基づくマウス参照配列の検証とほ乳類ゲノム多様性維持の戦略 (2018)
  • 著者名/発表者名: 権藤洋一
  • 学会等名: 基礎放射線医学セミナー
  • 招待講演
• [備考] ゲノムと変異の解析研究（権藤研究室）
  • URL: http://mls.med.u-tokai.ac.jp/gondo/index-e.html
• [備考] 東海大学医学部基礎医学系分子生命科学
  • URL: http://mls.med.u-tokai.ac.jp/member.html
• [備考] 東海大学医学部基礎医学系教員権藤洋一
  • URL: https://www.u-tokai.ac.jp/staff/detail/MDMwMDY2/MDk0MTY4