アデノウイルスと生体との相互作用解析とベクター開発への応用

2018 年度 実績報告書

• 研究課題/領域番号: 17H00863
• 研究機関: 大阪大学
• 研究代表者: 水口 裕之 大阪大学, 薬学研究科, 教授 (50311387)
• 研究期間 (年度): 2017-04-01 – 2021-03-31
• キーワード: ウイルス / 遺伝子 / 癌 / 免疫学 / バイオテクノロジー

研究実績の概要

現在、遺伝子治療や癌に対するウイルス療法等が、再び大きな注目を集めている。本研究では、近年新たな研究領域として開拓されてきたマイクロRNA（miRNA）や免疫誘導メカニズム、ゲノム編集の観点から、基礎に立ち返って、アデノウイルス（Ad）と宿主の攻防（ウイルスは細胞で複製に最適な環境を作ろうとするのに対し、細胞はそれを防ごうとする）を理解し、それらを遺伝子治療やワクチン、ウイルス療法、さらには基礎研究への応用に適した改良型Adベクターの開発につなげることを目的に研究を遂行した。H30年度は以下の成果を得た。
(1)Adと生体（細胞）との相互作用解析
①Ad複製の観点からの解析： VA-RNAIIの生理機能の解明を試み、VA-RNAIIのプロセシング産物であるmivaRNAIIが、CUL4Aの発現を抑制することで、Adの増殖を促進することを明らかにした。
②免疫誘導の観点からの解析： Adベクターを用いたHIVワクチンの臨床試験では、生体が有するヒト5型Adに対する既存抗体がワクチン効果に影響を及ぼしていることが報告されている。そこで、ヒト5型Adに対する既存抗体の主な標的であるヘキソン領域を改変したAdベクターの開発に着手した。また、異なる血清型に属するヒト35型Adからなら腫瘍溶解性Adの開発に着手した。
(2)CRISPR/Cas9システム搭載Adベクターの遺伝子治療や基礎研究としての有用性評価
異なる原核生物由来のAsCpf1及びLbCpf1搭載Adベクターの作製を行った。しかしながら、Ad-AsCpf1の回収タイター（力価）は低く、さらにAd-LbCpf1は取得が不可能であった。一方で、Ad-AsCpf1は高いゲノム編集効率を示したことから、機能的かつ高タイターのCpf1発現Adベクターの作製が今後の課題となった。

現在までの達成度 (区分)

2: おおむね順調に進展している

理由

(1)Adと生体（細胞）との相互作用解析
①Ad複製の観点からの解析：DicerがAd増殖に必須の因子であるVA-RNA Iを切断することで、Adの増殖を負に制御していること、さらにはDicerのノックダウンにより、Ad増殖が促進されること、Dicerを介した宿主miR-27の産生がSNAP25やTXN2の発現制御を通してAd感染を阻害することを明らかにした。
②免疫誘導の観点からの解析：Adは生体に投与すると免疫系を活性化することが知られており、これを逆に利用することで、ワクチンベクターとしても利用が期待されている。Adベクターを用いたHIVワクチンの臨床試験では、生体が有するヒト5型Adに対する既存抗体がワクチン効果に影響を及ぼしていることが報告されている。そこで、抗体の標的となることが想定されるヘキソンの7つのHVR（hexon hypervariable regions）領域に変異を導入したAdベクターの開発の開発を目的に、これらの領域を変異させたAdベクタープラスミドの作製を行った。また、ヒト5型Ad抗体の影響を受けないヒト35型Adからなら腫瘍溶解性Adの開発に着手した。
(2)CRISPR/Cas9システム搭載Adベクターの遺伝子治療や基礎研究としての有用性評価
近年新たに発見されたCpf1(Cas12a)は、Cas9とは異なった性質を持つことから、これを利用した新たなゲノム編集技術の開発が期待される。そこで、AsCpf1及びLbCpf1搭載Adベクター（Ad-AsCpf1、Ad-LbCpf1）の作製を行った。しかしながら、Ad-AsCpf1の回収タイター（力価）は低く、さらにAd-LbCpf1は取得が不可能であった。一方で、Ad-AsCpf1は高いゲノム編集効率を示したことから、機能的かつ高タイターのCpf1発現Adベクターの作製が今後の課題となった。

今後の研究の推進方策

(1)Adと生体（細胞）との相互作用解析
①Ad複製の観点からの解析：ヒト5型Adは小分子ノンコーディングRNAとしてVA-RNA Iに加え、VA-RNA IIもコードしている。本研究では、これまで研究が進んでいなかったVA-RNAIIの生理機能の解明を試み、VA-RNAIIのプロセシング産物であるmivaRNAIIが、CUL4Aの発現を抑制することで、Adの増殖を促進することを明らかにした。本研究成果は、腫瘍溶解性Adによるがん治療研究への応用に向けても極めて有用であり、次年度は本メカニズムを搭載したウイルス複製能に優れた新規腫瘍溶解性Adの作製とその抗腫瘍効果について検討する。
②免疫誘導の観点からの解析：Adベクターは現在、ベクター投与による生じる免疫反応を逆に利用して、HIVなどの新興・再興感染症に対するワクチンベクターとして利用する試みが盛んに行われている。Adベクターを用いたHIVワクチンの臨床試験では、生体が有するヒト5型Adに対する既存抗体がワクチン効果に影響を及ぼしていることが報告されている。そこでH30年度は、ヒト5型Adに対する既存抗体の主な標的であるヘキソン領域を改変したAd作製のための遺伝子組換えを行った。次年度は、ヘキソンHVR領域を変異させたAdベクターを作製し、ベクターとしての基本的特性について解析する。また、ヒト35型Adからなら腫瘍溶解性Adの特性を解析する。
(2)CRISPR/Cas9システム搭載Adベクターの遺伝子治療や基礎研究としての有用性評価
次年度は、Tet-Onシステムまたは肝臓特異的AHAプロモーターを用いることにより、ベクター増幅中のCpf1の発現を抑制することを試み、機能的かつ高タイターのCpf1発現Adベクターの作製とその特性解析を行う。

研究成果

• [雑誌論文] A MicroRNA Derived from Adenovirus Virus-Associated RNAII Promotes Virus Infection via Posttranscriptional Gene Silencing. (2019)
  • 著者名/発表者名: Wakabayashi K., Machitani M., Tachibana M., Sakurai F., Mizuguchi H.
  • 雑誌名: J. Virol. 巻: 93 ページ: e01265-18
  • DOI: 10.1128/JVI.01265-18.
  • 査読あり / オープンアクセス
• [雑誌論文] Generation of the adenovirus vector-mediated CRISPR/Cpf1 system and the application for primary human hepatocytes prepared from humanized mice with chimeric liver. (2018)
  • 著者名/発表者名: Tsukamoto T., Sakai E., Iizuka S., Taracena-Gandar M., Sakurai F., Mizuguchi H.
  • 雑誌名: Biol. Pharm. Bull. 巻: 41 ページ: 1089-1095
  • DOI: 10.1248/bpb.b18-00222.
  • 査読あり / オープンアクセス
• [雑誌論文] Antibodies against adenovirus fiber and penton base proteins inhibit adenovirus vector-mediated transduction in the liver following systemic administration. (2018)
  • 著者名/発表者名: Tomita K., Sakurai F., Iizuka S., Hemmi M., Wakabayashi K., Tachibana M., Katayama K., Kamada H., Mizuguchi H.
  • 雑誌名: Sci. Rep. 巻: 8 ページ: 12315
  • DOI: 10.1038/s41598-018-30947-z.
  • 査読あり / オープンアクセス
• [雑誌論文] A flow cytometry-based Method to determine the titer of adenoviruses expressing an extraneous gene. (2018)
  • 著者名/発表者名: Asada A., Hayakawa H., Yanase N., Abe K., Sakurai F., Mizuguchi H., Urata Y.
  • 雑誌名: Biol. Pharm. Bull. 巻: 41 ページ: 1615-1619
  • DOI: 10.1248/bpb.b18-00316.
  • 査読あり / オープンアクセス
• [雑誌論文] Detection of circulating tumor cells in cervical cancer using a conditionally replicative adenovirus targeting telomerase-positive cells. (2018)
  • 著者名/発表者名: Takakura M., Matsumoto T., Nakamura M., Mizumoto Y., Myojyo S., Yamazaki R., Iwadare J., Bono Y., Orisaka S., Obata T., Izuka T., Kagami K., Nakayama K., Hayakawa H., Sakurai F., Mizuguchi H., Urata Y., Fujiwara T., Kyo S., Sasagawa T., Fujiwara H.
  • 雑誌名: Cancer Sci. 巻: 109 ページ: 231-240
  • DOI: 10.1111/cas.13449
  • 査読あり / オープンアクセス
• [雑誌論文] Clinical features of squamous cell lung cancer with anaplastic lymphoma kinase (ALK)-rearrangement: a retrospective analysis and review. (2018)
  • 著者名/発表者名: Watanabe J., Togo S., Sumiyoshi I., Namba Y., Suina K., Mizuno T., Kadoya K., Motomura H., Iwai M., Nagaoka T., Sasaki S., Hayashi T., Uekusa T., Abe K., Urata Y., Sakurai F., Mizuguchi H., Kato S., Takahashi K.
  • 雑誌名: Oncotarget 巻: 9 ページ: 24000-24013
  • DOI: 10.18632/oncotarget.25257.
  • 査読あり / オープンアクセス
• [学会発表] 高タイターCpf1発現アデノウイルスベクターの作製 (2019)
  • 著者名/発表者名: 塚本智仁、酒井英子、櫻井文教、水口裕之
  • 学会等名: 日本薬学会第139年会
• [学会発表] ゲノム編集技術を利用したアデノウイルスベクターの新規改変法の開発 (2019)
  • 著者名/発表者名: 西前文敬、若林圭作、塚本智仁、櫻井文教、水口裕之
  • 学会等名: 日本薬学会第139年会
• [学会発表] CRISPR/Cpf1搭載アデノウイルスベクターの作製とヒト肝細胞キメラマウス由来肝細胞への適用 (2018)
  • 著者名/発表者名: 塚本智仁、酒井英子、櫻井文教、水口裕之
  • 学会等名: 第65回日本生化学会近畿支部例会
• [学会発表] CRISPR/Cpf1搭載アデノウイルスベクターの作製 (2018)
  • 著者名/発表者名: 塚本智仁、酒井英子、櫻井文教、水口裕之
  • 学会等名: 日本ゲノム編集学会第3回大会
• [学会発表] Suppression of oncolytic adenovirus-mediated hepatotoxicity by liver-specific inhibition of NF-kB (2018)
  • 著者名/発表者名: Machitani M., Sakurai F., Wakabayashi K., Tachibana M., Kato N., Fujiwara T., Mizuguchi H.
  • 学会等名: 第24回日本遺伝子細胞治療学会学術集会
• [学会発表] アデノウイルスが発現するVA-RNAIIは、microRNAの前駆体としてAdの増殖に寄与する (2018)
  • 著者名/発表者名: 若林圭作、町谷充洋、櫻井文教、水口裕之
  • 学会等名: 第41回日本分子生物学会年会
• [図書] ドラッグデリバリーシステム-バイオ医薬品創成に向けた組織、細胞内、核内送達技術の開発- (担当:分担執筆, 範囲:第22 章 粘膜免疫誘導型ワクチンとしてのアデノウイルスベクター) (2018)
  • 著者名/発表者名: 立花雅史、邊見昌久、水口裕之
  • 総ページ数: 260
  • 出版者: CMC出版
  • ISBN: 978-4-7813-1333-7
• [図書] バイオロジクスの開発と品質・安全性確保 下巻 (担当:分担執筆, 範囲:第2章第1節 アデノウイルスベクター) (2018)
  • 著者名/発表者名: 水口裕之・早川堯夫
  • 総ページ数: 504
  • 出版者: エル・アイ・シー出版
  • ISBN: 978-4-900487-57-4
• [産業財産権] 腫瘍溶解性ヒト35型アデノウイルス (2019)
  • 発明者名: 水口裕之、櫻井文教
  • 権利者名: 大阪大学
  • 産業財産権種類: 特許
  • 産業財産権番号: US62/804,334
  • 外国