| 研究課題/領域番号 |
17H01380
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| 研究機関 | 名古屋大学 |
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研究代表者 |
貝淵 弘三 名古屋大学, 医学系研究科, 教授 (00169377)
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| 研究分担者 |
永井 拓 名古屋大学, 医学部附属病院, 准教授 (10377426)
天野 睦紀 名古屋大学, 医学系研究科, 准教授 (90304170)
西岡 朋生 名古屋大学, 医学系研究科, 助教 (70435105)
黒田 啓介 名古屋大学, 医学系研究科, 特任助教 (80631431)
船橋 靖広 名古屋大学, 医学系研究科, 助教 (00749913)
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| 研究期間 (年度) |
2017-04-01 – 2021-03-31
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| キーワード | 神経科学 / シグナル伝達 / リン酸化 / プロテオミクス解析 / ニューロモジュレーター / 神経活動 / 情動行動 / 学習 |
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| 研究実績の概要 |
本研究課題では情動行動とその学習に関連するリン酸化シグナルを網羅的に解析し、その作用を簡易にモニター・分子操作する系を開発する。さらに、リン酸化シグナルによる神経細胞の興奮性や可塑性の制御機構を解明し、情動行動・学習との関連を明らかにすることを目的とする。本年度は項目(1)~(6)の研究を実施した。(1)リン酸化プロテオミクスによる神経伝達物質のリン酸化シグナル解析：ドーパミン(D2R)、アセチルコリン、グルタミン酸(NMDA)刺激でリン酸化されるリン酸化基質および変動するリン酸化部位を同定し、KANPHOSデータベースに内部データとして登録した。リン酸化タンパク質結合タンパク質14-3-3を神経細胞種特異的に発現させることにより、神経細胞種特異的なin vivoリン酸化プロテオミクス解析を行う技術を開発した。(2)リン酸化シグナル伝達の時空間的モニタリング法の開発と応用：Rho-キナーゼの活性を時空間的にモニターすることのできるFRETプローブを共同開発した。(3)リン酸化シグナル分子の分子操作法の開発と応用：LOV-Trap法により光刺激依存的にRhoキナーゼの活性を制御する分子ツールを開発した。(4)神経細胞の膜興奮性を制御する機構の解析：ドーパミンによるKCNQチャネル制御機構について検討し、線条体においてドーパミン刺激はD1R-MSNの電位依存性のカリウム電流（M電流）を制御することを示した。(5)シナプス可塑性の制御機構の解析：Rho-キナーゼの基質として同定したDlg2やShank3、SynGAP1のリン酸化部位を同定し、抗リン酸化抗体とリン酸化部位変異体を作成した。(6)神経可塑性に関与する遺伝子発現機構の解析：MAPKの基質として同定した転写因子Npas4やMkl2のリン酸化部位を同定し、抗リン酸化抗体とリン酸化部位変異体を作成した。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
2: おおむね順調に進展している
理由
(1)リン酸化プロテオミクスによる神経伝達物質のリン酸化シグナル解析：ドーパミン (D2R)、アセチルコリン、グルタミン酸（NMDA）刺激でリン酸化されるリン酸化基質および変動するリン酸化部位を同定し、KANPHOSに内部データとして登録した。in vivoリン酸化プロテオミクス解析は順調に進展しており、新たなリン酸化基質を同定しつつある。
(2)リン酸化シグナル伝達の時空間的モニタリング法の開発と応用：Rho-キナーゼの活性を時空間的にモニターすることのできるFRETプローブは開発が完了した。
(3)リン酸化シグナル分子の分子操作法の開発と応用：LOV-Trap法により光刺激依存的にRhoキナーゼの活性を制御する分子ツールは開発が完了した。
(4)神経細胞の膜興奮性を制御する機構の解析：ドーパミンによるKCNQチャネル制御機構について検討し、線条体においてドーパミン刺激はD1R-MSNの電位依存性のカリウム電流（M電流）を制御することを示した。
(5)シナプス可塑性の制御機構の解析：Rho-キナーゼの基質候補として同定したDlg2やShank3、SynGAP1のリン酸化部位を同定し、抗リン酸化抗体とリン酸化部位変異体の作製が完了した。
(6)神経可塑性に関与する遺伝子発現機構の解析：MAPKの基質候補として同定した転写因子Npas4やMkl2のリン酸化部位を同定し、抗リン酸化抗体とリン酸化部位変異体の作製が完了した。
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| 今後の研究の推進方策 |
(1)リン酸化プロテオミクスによる神経伝達物質のリン酸化シグナル解析：アデノシン刺激でリン酸化されるリン酸化基質および変動するリン酸化部位を同定し、KANPHOSに内部データとして登録する。in vivoリン酸化プロテオミクス解析を遂行し、新たなリン酸化基質を同定する。
(2)リン酸化シグナル伝達の時空間的モニタリング法の開発と応用：PKCのFRETプローブについても開発を進める。
(3)リン酸化シグナル分子の分子操作法の開発と応用：Rhoキナーゼ以外にも光刺激依存的にPKA、MAPK、PKCの活性を制御する分子ツールの開発を進める。
(4)神経細胞の膜興奮性を制御する機構の解析：KCNQチャネルのリン酸化プロテオミクス解析から同定されたリン酸化候補部位に対して抗リン酸化抗体を作製することで、線条体におけるKCNQチャネル制御機構の分子メカニズムを明らかにする。
(5)シナプス可塑性の制御機構の解析：作製した抗リン酸化抗体とリン酸化部位変異体を用い、CaMKⅡやRho-Kinaseを介したシナプスタンパク質のリン酸化によるシナプス可塑性の制御機構を解析する。
(6)神経可塑性に関与する遺伝子発現機構の解析：作製した抗リン酸化抗体とリン酸化部位変異体を用い、MAPKを介した転写因子のリン酸化による遺伝子発現の制御機構を解析する。
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