| 研究課題/領域番号 |
17H01380
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| 研究機関 | 名古屋大学 |
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研究代表者 |
貝淵 弘三 名古屋大学, 医学系研究科, 教授 (00169377)
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| 研究分担者 |
永井 拓 名古屋大学, 医学部附属病院, 准教授 (10377426)
天野 睦紀 名古屋大学, 医学系研究科, 准教授 (90304170)
西岡 朋生 名古屋大学, 医学系研究科, 助教 (70435105)
黒田 啓介 名古屋大学, 医学系研究科, 特任助教 (80631431)
船橋 靖広 名古屋大学, 医学系研究科, 助教 (00749913)
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| 研究期間 (年度) |
2017-04-01 – 2021-03-31
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| キーワード | 神経科学 / シグナル伝達 / リン酸化 / プロテオミクス解析 / ニューロモジュレーター / 神経活動 / 情動行動 / 学習 |
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| 研究実績の概要 |
(1)リン酸化プロテオミクスによる神経伝達物質のリン酸化シグナル解析：グルタミン酸(NMDA)やアデノシン刺激によりリン酸化されるリン酸化基質および変動するリン酸化部位を同定した。また、D1R-MSNおよびD2R-MSN特異的なドーパミンおよびアデノシンの作用機序を解明し、D1R-MSNからD2R-MSNへ、またはその逆への活性シフトが、主にドーパミン濃度の変化に依存するというモデルを提案した(Zhang et al. Neurochem Int. 2019)。
(2)リン酸化シグナル伝達の時空間的モニタリング法の開発と応用：Rho-kinaseとその基質であるMYPT1のキナーゼ・基質相互作用について解析を行い、新たにRho-kinaseとの相互作用に必要なドッキングモチーフを見出した。
(3)リン酸化シグナル分子の分子操作法の開発と応用：PKA、PKC、CaMKⅡの偽基質配列を用い、光刺激依存的にキナーゼ活性を制御する分子ツールの開発に着手した。
(4)神経細胞の膜興奮性を制御する機構の解析：MAPKによるKCNQ2のリン酸化部位に対する抗リン酸化抗体を作製した。D1R作動薬で刺激した線条体スライスにおいてKCNQ2のリン酸化が亢進し、このリン酸化の亢進はMEK阻害剤の処置で抑制された。
(5)シナプス可塑性の制御機構の解析：KClやNMDAで刺激した線条体スライスにおいてShank3のリン酸化が亢進し、そのリン酸化の亢進はRho-キナーゼ阻害剤の処置により抑制された。
(6)神経可塑性に関与する遺伝子発現機構の解析：D1R/PKAを活性化した線条体神経細胞において転写因子Npas4やMkl2のリン酸化が亢進し、そのリン酸化はMEK阻害剤により抑制された。さらに、MAPKによるNpas4のリン酸化によりNPAS4の転写活性が増強し、報酬学習・記憶に関与することを見出した。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
2: おおむね順調に進展している
理由
(1)リン酸化プロテオミクスによる神経伝達物質のリン酸化シグナル解析：本年度までにドーパミン(D2R)、アセチルコリン、グルタミン酸(NMDA)、アデノシン刺激でリン酸化されるリン酸化基質および変動するリン酸化部位を同定し、KANPHOSデータベースに内部データとして登録した。また、D1R-MSNおよびD2R-MSN特異的なドーパミンおよびアデノシンの作用機序を解明し、論文を発表した (Zhang et al. Neurochem Int. 2019)。
(2)リン酸化シグナル伝達の時空間的モニタリング法の開発と応用：Rho-KinaseのMYPT1のドッキング部位とドッキングモチーフを同定した。
(3)リン酸化シグナル分子の分子操作法の開発と応用：偽基質配列がPKA、PKC、CaMKⅡのキナーゼ活性を制御することを確認した。偽基質配列とLOVを融合させることで光刺激依存的にキナーゼ活性を制御するツールの開発を進めている。
(4)神経細胞の膜興奮性を制御する機構の解析：MAPKによるKCNQ2のリン酸化部位(S414, S476)に対する抗リン酸化抗体を作製した。D1R作動薬で刺激した線条体スライスにおいてKCNQ2のリン酸化が亢進し、このリン酸化の亢進はMEK阻害剤の処置で抑制されることを示した。
(5)シナプス可塑性の制御機構の解析：KClやNMDAで刺激した線条体スライスにおいてShank3のS551, S694, S781のリン酸化が亢進し、そのリン酸化の亢進はRho-キナーゼ阻害剤の処置により抑制されることを示した。
(6)神経可塑性に関与する遺伝子発現機構の解析：ドーパミンがD1R/PKA/MAPKシグナルを介して、Npas4などの転写因子をリン酸化し、報酬学習・記憶を制御することを見出した。以上のように、本研究はおおむね順調に進展していると考える。
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| 今後の研究の推進方策 |
(1)リン酸化プロテオミクスによる神経伝達物質のリン酸化シグナル解析：引き続きアデノシン刺激によるリン酸化プロテオミクス解析を進めリン酸化基質の同定数を増やすと共に、セロトニン刺激でリン酸化されるリン酸化基質および変動するリン酸化部位を同定する。in vivoリン酸化プロテオミクス解析を遂行し、新たなリン酸化基質を同定する。
(2)リン酸化シグナル伝達の時空間的モニタリング法の開発と応用：引き続き、キナーゼの基質認識機構の解析およびキナーゼの活性調節・モニターツールの開発を行う。本年度に同定したMYPT1のドッキングモチーフを基に、Rho-kinaseの機能抑制ペプチドや活性モニターツールの作製・評価を試みる。
(3)リン酸化シグナル分子の分子操作法の開発と応用：偽基質配列とLOVを融合させ、光刺激依存的にPKA、PKC、CaMKⅡの活性を制御する分子ツールの開発を進める。
(4)神経細胞の膜興奮性を制御する機構の解析：KCNQ2チャネルのリン酸化修飾の役割をin vivoで明らかにするため、遺伝子編集技術を用いてKCNQ2リン酸化部位欠損変異マウスを作製し、生理解析を行う。
(5)シナプス可塑性の制御機構の解析：CaMKⅡの基質候補として同定したArhGAP21およびArhGAP39について抗リン酸化抗体を作製し、リン酸化の変動を解析する。Rho-Kinaseの基質として同定したShank3に関して、リン酸化部位変異体を発現するウイルスベクターを作製し、スパイン形態やPSD95などの足場タンパク質との相互作用、AMPA型受容体やNMDA型受容体の膜上への局在を解析する。同時に、電気生理学的解析を行い、シナプス可塑性との関連も明らかにする。
(6)神経可塑性に関与する遺伝子発現機構の解析：引き続きMAPKによるNpas4やMkl2のリン酸化による、報酬学習・記憶の制御機構を解析する。
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| 備考 |
平成29年11月3日 紫綬褒章 受賞
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