オンデマンドゲノム編集技術の開発と実験動物学への応用

2018 年度 実績報告書

• 研究課題/領域番号: 17H01394
• 研究機関: 大阪大学
• 研究代表者: 伊川 正人 大阪大学, 微生物病研究所, 教授 (20304066)
• 研究期間 (年度): 2017-04-01 – 2021-03-31
• キーワード: 実験動物 / ゲノム編集 / ウイルスベクター / CRISPR/cas9 / ES細胞

研究実績の概要

本研究は、オンデマンドゲノム編集システムの開発と、その応用である生殖不全マウスの重点解析を2つの大きな柱にして研究を進めている。さらにサブテーマを設けて目標を明確にし、連携研究者を担当者に配置することで、問題点の早期発見・解決および効率的に研究を推進している。
平成30年度もCRISPR/Cas9 システムゲノム編集システムの改良を中心に進めた。従来のCas9 システムでは標的20塩基に加えて直下のPAM配列 (NGG) を認識し、Cas9 タンパク質により標的配列を切断するため、PAM 配列が標的選びを制限する問題があった。そこで東京大学で作製された改良型spCas9 (NGGではなくNGNをPAM配列とする)を用いてゲノム編集動物作製効率を検討した。残念ながら受精卵への前核注入やエレクトロポレーション (EP) では、種々の条件を試したもののゲノム編集マウスを得ることはできなかった。一方、ES細胞では、頻度は劣るもののゲノム編集クローンを樹立することができたことから、標的配列の選択幅が広がった。
また胚性致死遺伝子の生後機能解析に有効なキメラ解析を達成するために、ミトコンドリアが赤色、先体が緑色蛍光で標識された精子を作るトランスジェニックマウス系統からES細胞を樹立した。その応用として、胚性致死遺伝子であるHydinを欠損したES細胞がキメラ動物内では精子に分化できることを示した。さらに、Hydin欠損細胞由来の精子は鞭毛形成異常を示すことを明らかにして論文報告した。他にもCmtm2やGk2など、雄性不妊となる遺伝子の同定に成功し、論文報告している。

現在までの達成度 (区分)

2: おおむね順調に進展している

理由

改良型Cas9をES細胞に応用することで、従来は切断できなかったGGを持たない繰り返し配列などもゲノム編集できるようになった。NGN型Cas9については共同研究成果としてScience誌に報告した。また遺伝子破壊により雄性不妊となる遺伝子群について、複数論文報告した。

今後の研究の推進方策

引き続き、ゲノム編集技術の開発とその応用による生殖関連遺伝子機能解析を行う。特にNG型Cas9については、spCas9に加えてsaCas9についても改良を加えて検討を続け、全ての配列に対応するゲノム編集システムの構築を目指す。なお、汎用性を高めるために、受精卵EPによるゲノム編集動物作製の効率化にも取り組む。

研究成果

• [国際共同研究] Baylor College of Medecine/University of Hawai(米国)
  • 国名: 米国
  • 外国機関名: Baylor College of Medecine/University of Hawai
• [国際共同研究] Seoul National University(韓国)
  • 国名: 韓国
  • 外国機関名: Seoul National University
• [雑誌論文] Seminal vesicle secretory protein 7, PATE4, is not required for sperm function but for copulatory plug formation to ensure fecundity. (2019)
  • 著者名/発表者名: Noda T, Fujihara Y, Matsumura T, Oura S, Kobayashi S, Ikawa M.
  • 雑誌名: Biology of reproduction 巻: 印刷中 ページ: 印刷中
  • DOI: 10.1093/biolre/ioy247.
  • 査読あり / オープンアクセス
• [雑誌論文] Chimeric analysis with newly established EGFP/DsRed2-tagged ES cells identify HYDIN as essential for spermiogenesis in mice. (2019)
  • 著者名/発表者名: Oura S, Miyata H, Noda T, Shimada K, Matsumura T, Morohoshi A, Isotani A, Ikawa M.
  • 雑誌名: Experimental animals 巻: 68 ページ: 25-34
  • DOI: 10.1538/expanim.18-0071.
  • 査読あり / オープンアクセス
• [雑誌論文] PTBP1 contributes to spermatogenesis through regulation of proliferation in spermatogonia. (2018)
  • 著者名/発表者名: Senoo M, Takijiri T, Yoshida N, Ozawa M, Ikawa M.
  • 雑誌名: The Journal of reproduction and development 巻: 65 ページ: 37-46
  • DOI: 10.1262/jrd.2018-109.
  • 査読あり / オープンアクセス
• [雑誌論文] Infection with flaviviruses requires BCLXL for cell survival. (2018)
  • 著者名/発表者名: Suzuki T, Okamoto T, Katoh H, Sugiyama Y, Kusakabe S, Tokunaga M, Hirano J, Miyata Y, Fukuhara T, Ikawa M, Satoh T, Yoshio S, Suzuki R, Saijo M, Huang DCS, Kanto T, Akira S, Matsuura Y.
  • 雑誌名: PLoS Pathog 巻: 14 ページ: e1007299.
  • DOI: 10.1371/journal.ppat.1007299.
  • 査読あり / オープンアクセス
• [雑誌論文] Co-expression of sperm membrane proteins CMTM2A and CMTM2B is essential for ADAM3 localization and male fertility in mice. (2018)
  • 著者名/発表者名: Fujihara Y, Oji A, Kojima-Kita K, Larasati T, Ikawa M.
  • 雑誌名: Journal of cell science 巻: 131 ページ: ー
  • DOI: 10.1242/jcs.221481.
  • 査読あり / オープンアクセス
• [雑誌論文] RSPH6A is required for sperm flagellum formation and male fertility in mice. (2018)
  • 著者名/発表者名: Abbasi F, Miyata H, Shimada K, Morohoshi A, Nozawa K, Matsumura Y, Xu Z, Pratiwi P, Ikawa M.
  • 雑誌名: Journal of cell science 巻: 131 ページ: ー
  • DOI: 10.1242/jcs.221648.
  • 査読あり / オープンアクセス
• [雑誌論文] Engineered CRISPR-Cas9 nuclease with expanded targeting space. (2018)
  • 著者名/発表者名: Nishimasu H, Shi X, Ishiguro S, Gao L, Hirano S, Okazaki S, Noda T, Abudayyeh OO, Gootenberg JS, Mori H, Oura S, Holmes B, Tanaka M, Seki M, Hirano H, AburataniH, Ishitani R, Ikawa M, Yachie N, Zhang F, Nureki O.
  • 雑誌名: Science 巻: 361 ページ: 1259-1562
  • DOI: 10.1126/science.aas9129.
  • 査読あり / オープンアクセス / 国際共著
• [学会発表] New Insights into the Molecular Events of Mammalian Fertilization (2019)
  • 著者名/発表者名: Ikawa M
  • 学会等名: Fifth International Oocyte Meeting
  • 国際学会 / 招待講演
• [学会発表] CRISPR/Cas9 Mediated Genome Editing in Mice and Its Application for the Study of Reproduction (2018)
  • 著者名/発表者名: Ikawa M
  • 学会等名: Yanagimachi 90th Birthday Symposium
  • 国際学会 / 招待講演
• [学会発表] CRISPR/Cas9 Mediated Genome Editing in Mice and Its Application for the Study of Reproduction (2018)
  • 著者名/発表者名: Ikawa M
  • 学会等名: 7th International Conference on the Epididymis
  • 国際学会 / 招待講演
• [備考] 研究室ホームページ
  • URL: http://www.egr.biken.osaka-u.ac.jp/information/results/index.html