オンデマンドゲノム編集技術の開発と実験動物学への応用

2019 年度 実績報告書

• 研究課題/領域番号: 17H01394
• 研究機関: 大阪大学
• 研究代表者: 伊川 正人 大阪大学, 微生物病研究所, 教授 (20304066)
• 研究期間 (年度): 2017-04-01 – 2021-03-31
• キーワード: 実験動物 / ゲノム編集 / ウイルスベクター / CRISPR/cas9 / ES細胞 / 不妊

研究実績の概要

本研究は、オンデマンドゲノム編集システムの開発と、その応用である生殖不全マウスの重点解析を2つの大きな柱にして研究を進めている。さらにサブテーマを設けて目標を明確にし、連携研究者を担当者に配置することで、問題点の早期発見・解決および効率的に研究を推進している。
平成31年度もCRISPR/Cas9 システムゲノム編集システムの改良を進めた。前年度までに、標的20塩基直下のPAM配列として (NGG) ではなく、(NGN) を認識するNGN型Cas9を用いる場合、受精卵ゲノム編集は難しいものの、ES細胞では比較的効率的にゲノム編集できること示していた。平成31年度は、NGN型Cas9が優位性を発揮できる部分として、タンパク質のN末端やC末端へのタグ挿入を想定し、翻訳開始コドンATG、終止コドン (TAG/TGA) を標的としたゲノム編集への応用を試みた。残念ながら、近傍のNGGを標的に野生型Cas9を用いたゲノム編集効率の方が高いことが判明した。
一方で、ゲノム編集効率の悪い長領域欠損をES細胞と組み合わせてノックアウトマウスを作製することにより、ファミリー遺伝子をまとめて生理機能解析することに成功した。その結果、Pateファミリー、Cstファミリー遺伝子群が、精子ADAM3の成熟と雄の妊孕性に必須であることを見出し、論文報告した。それ以外に、精巣特異的に発現する30遺伝子が単独で欠損しても雄の妊孕性に影響ないものの、Drc7やKif9, Mtl5, Lypd4, Pate4, Tcp11が雄の妊孕性に重要なことを明らかにし、それぞれ論文発表した。

現在までの達成度 (区分)

2: おおむね順調に進展している

理由

NGN型Cas9の汎用性は低いものの、標的によっては十分に活性を示すことが分かった。また遺伝子破壊マウスを効率的に作製することで、雄性不妊となる遺伝子群を、多数論文報告した。

今後の研究の推進方策

引き続き、ゲノム編集技術の開発とその応用による生殖関連遺伝子機能解析を行う。特にNGN型Cas9については、spCas9に加えてsaCas9についても改良を加えて検討を続け、全ての配列に対応するゲノム編集システムの構築を目指す。なお、汎用性を高めるために、受精卵EPによるゲノム編集動物作製の効率化にも取り組む。欠損すると雄性不妊となる遺伝子群から、精子形成や精子機能獲得メカニズムを明らかにする。

研究成果

• [国際共同研究] Baylor College of Medecine/University of Hawai(米国)
  • 国名: 米国
  • 外国機関名: Baylor College of Medecine/University of Hawai
• [国際共同研究] Seoul National University(韓国)
  • 国名: 韓国
  • 外国機関名: Seoul National University
• [雑誌論文] CRISPR/Cas9-mediated genome editing reveals Oosp family genes are dispensable for female fertility in mice. (2020)
  • 著者名/発表者名: Abbasi F, Kodani M, Emori C, Kiyozumi D, Mori M, Fujihara Y, Ikawa M.
  • 雑誌名: Cells 巻: 9 ページ: E821
  • DOI: 10.3390/cells9040821.
  • 査読あり / オープンアクセス
• [雑誌論文] Nexin-Dynein Regulatory Complex component DRC7 but not FBXL13 is required for sperm flagellum formation and male fertility in mice. (2020)
  • 著者名/発表者名: Morohoshi A, Miyata H, Shimada K, Nozawa K, Matsumura T, Yanase R, Shiba K, Inaba K, Ikawa M.
  • 雑誌名: PLOS Genetics 巻: 16 ページ: e1008585
  • DOI: 10.1371/journal.pgen.1008585.
  • 査読あり / オープンアクセス
• [雑誌論文] Genetic mutation of Frem3 does not cause Fraser syndrome in mice (2020)
  • 著者名/発表者名: Kiyozumi D, Mori M, Kodani M, Ikawa M.
  • 雑誌名: Experimental Animals 巻: 69 ページ: 104-109
  • DOI: 10.1538/expanim.19-0088.
  • 査読あり / オープンアクセス
• [雑誌論文] Male mice, caged in the International Space Station for 35 days, sire healthy offspring (2019)
  • 著者名/発表者名: Takafumi Matsumura, Taichi Noda, Masafumi Muratani, Risa Okada, Mutsumi Yamane, Ayako Isotani, Takashi Kudo, Satoru Takahashi, Masahito Ikawa
  • 雑誌名: Scientific Reports 巻: 9 ページ: 13733
  • DOI: 10.1038/s41598-019-50128-w.
  • 査読あり / オープンアクセス
• [雑誌論文] Identification of multiple male reproductive tract-specific proteins that regulate sperm migration through the oviduct in mice (2019)
  • 著者名/発表者名: Fujihara Y, Noda T, Kobayashi K, Oji A, Kobayashi S, Matsumura T, Larasati T, Oura S, Kojima-Kita K, Yu Z, Matzuk MM, Ikawa M.
  • 雑誌名: Proc Natl Acad Sci U S A 巻: 116 ページ: 18498-18506
  • DOI: 10.1073/pnas.1908736116
  • 査読あり / オープンアクセス / 国際共著
• [雑誌論文] CRISPR/Cas9-mediated genome editing reveals 30 testis-enriched genes dispensable for male fertility in mice (2019)
  • 著者名/発表者名: Lu Y, Oura S, Matsumura T, Oji A, Sakurai N, Fujihara Y, Shimada K, Miyata H, Tobita T, Noda T, Castaneda JM, Kiyozumi D, Zhang Q, Larasati T, Young SAM, Kodani M, Huddleston CA, Robertson MJ, Coarfa C, Isotani A, Aitken RJ, Okabe M, Matzuk MM, Garcia TX, Ikawa M.
  • 雑誌名: Biol Reprod 巻: 101 ページ: 501-511
  • DOI: 10.1093/biolre/ioz103.
  • 査読あり / オープンアクセス / 国際共著
• [雑誌論文] Nine genes abundantly expressed in the epididymis are not essential for male fecundity in mice. (2019)
  • 著者名/発表者名: Noda T, Sakurai N, Nozawa K, Kobayashi S, Devlin DJ, Matzuk MM, Ikawa M.
  • 雑誌名: Androl 巻: 7 ページ: 644-653
  • DOI: 10.1111/andr.12621
  • 査読あり / 国際共著
• [雑誌論文] Lvrn expression is not critical for mouse placentation. (2019)
  • 著者名/発表者名: Tobita T, Kiyozumi D, Muto M, Noda T, Ikawa M.
  • 雑誌名: J Reprod Dev. 巻: 65 ページ: 239-244
  • DOI: 10.1262/jrd.2018-157.
  • 査読あり / オープンアクセス
• [雑誌論文] Glycerol kinase 2 is essential for proper arrangement of crescent-like mitochondria to form the mitochondrial sheath during mouse spermatogenesis. (2019)
  • 著者名/発表者名: Shimada K, Kato H, Miyata H, Ikawa M.
  • 雑誌名: J Reprod Dev. 巻: 65 ページ: 155-162
  • DOI: 10.1262/jrd.2018-136.
  • 査読あり / オープンアクセス
• [学会発表] CRISPR/Cas9 Mediated Genome Editing and Its Application for the Study of Fertilization (2019)
  • 著者名/発表者名: Masahito Ikawa
  • 学会等名: Gordon Research Conference (Germ Cell Programming in Vertebrate Biology, Medicine and Biotechnology)
  • 国際学会 / 招待講演
• [学会発表] CRISPR/Cas9 Mediated Genome Editing in Mice (2019)
  • 著者名/発表者名: 伊川正人
  • 学会等名: The 15th Transgenic Technology Meeting
  • 招待講演
• [学会発表] ゲノム編集による遺伝子改変マウス作製と生殖医学研究への応用 (2019)
  • 著者名/発表者名: 伊川正人
  • 学会等名: 第30回日本医学会総会 2019
  • 招待講演
• [学会発表] ゲノム編集と生殖医学研究 (2019)
  • 著者名/発表者名: 伊川正人
  • 学会等名: 第18回生殖バイオロジー東京シンポジウム
  • 招待講演
• [学会発表] CRISPR/Cas9 mediated genome editing and its application for the study of reproduction (2019)
  • 著者名/発表者名: Masahito Ikawa
  • 学会等名: CEBST2019
  • 国際学会 / 招待講演
• [備考] 研究室ホームページ
  • URL: https://egr.biken.osaka-u.ac.jp/