研究課題
心筋梗塞により心臓の一部は壊死し炎症が生じる。炎症は、内皮細胞に好中球や単球などが接着することで開始される。また、心筋梗塞などの虚血時には、プロトン濃度の上昇（pHの低下）が観察される。プロトン濃度の上昇によりイオンチャネルやGタンパク質共役型受容体（プロトン感知性GPCR）が活性化される。そこで、内皮細胞に強く発現しているプロトン感知性GPCRの一つGPR4の炎症における役割を明らかにした。心筋梗塞により壊死した部位は欠落し、コラーゲンによって補填される。コラーゲンを産生する細胞が筋線維芽細胞である。筋線維芽細胞は組織常在性の線維芽細胞が分化し生じる。筋線維芽細胞の出現をリガンドによって制御できれば、筋線維芽細胞の役割や機能などの解析に大きく役立つ。この目的のために利用できる方法がDREADテクノロジーである。DREADはDesigner Receptors Exclusively Activated by Designer Drugの略で、合成リガンド（クロザピン－N－オキシド、CNO）によってのみ活性化されるGPCRである。GPCRを介した応答はGs、Gi、Gq、G12およびG13の5種のGタンパク質を介したシグナルに分類できる。Gs、Gi、Gqを活性化するDREADはすでに作成されていることから、G13を活性化するDREADを作成した。今後、G12を活性化するDREADを作成した後、線維芽細胞から筋線維芽細胞への分化を促進あるいは抑制するDREADを発現させたマウスを作成する。マウスをCNOで処置し筋線維芽細胞を出現させ、心機能や炎症性サイトカインなどを測定する。これにより筋線維芽細胞の分化と心機能や炎症応答との関係を明らかにできる。また、いったん筋線維芽細胞へ分化させた後、CNO刺激を中止すると筋線維芽細胞がどのように変化するのかも検討する。
2: おおむね順調に進展している
心筋梗塞後の心臓ではプロトン濃度が上昇していることを、pH感知性色素を用いて確認した。プロトン濃度の上昇は、梗塞後7日目でも観察された。プロトン感知性GPCRの一つGPR4の遺伝子をノックアウトしたマウスでは、好中球の内皮細胞への接着に必要な因子ICAMの発現が減少し、浸潤も抑制されていた。また、ノックアウトマウスでは、炎症性サイトカインのTNF-α、IL-6などの発現の抑制および心機能の改善も観察された。GPR4がプロトン濃度の上昇により活性化されていることをin vivoで確認するため、プロトンが結合すると考えられるHisをAlaに変えた変異体を作成した。Ala置換型変異体は、野生型と同じ程度細胞表面に発現し、プロトン濃度を増加させてもGタンパク質を活性化しなかった。今後、Ala置換型変異体を内皮細胞選択的な発現を与えるプロモーターを用いて内皮細胞に発現させ、心筋梗塞後の炎症応答や心機能を検討する。これにより心筋梗塞後のプロトン濃度の上昇が好中球の内皮細胞への接着、炎症応答および心機能の低下に大きな役割を果たしていることを示す。また、三量体Gタンパク質のG13を選択的に活性化するDREADを作成した。リゾホスファチジン酸（LPA）受容体はG13を選択的に活性化すると報告されている。Gタンパク質とのカップリング選択性は細胞内第3ループとカルボキシル末端により決定されている。LPA受容体のこれら領域をGq-DREADの相当する部分と置き換えた。G13を活性化する受容体はGqも活性化するとの多くの報告があるものの、作成したDREADはGqを活性化しなかった。G13とは異なる応答を引き起こすG12を選択的に活性化するDREADを作成中である。このように、おおむね順調に進行している。
GPR4の野生型およびAla置換型変異体を内皮細胞に発現させるため、両受容体を内皮細胞選択的プロモーター下に組み込んだアデノ随伴ウイルスを作成する。GPR4をノックアウトさせた新生仔マウスに感染させると、成熟マウスの心筋細胞選択的に発現させることができる。マウスに心筋梗塞処置を行い、炎症性サイトカインの発現、接着分子の発現、心機能などを測定する。Ala置換型GPR4変異体は、ノックアウトマウスに似た応答を示すと予想している。また、G12を活性化するDREADを作成した後、線維芽細胞から筋線維芽細胞への分化を促進および抑制するDREADを同定する。この後、これらのDREADを線維芽細胞選択的プロモーター下に組み込んだトランスジェニックマウスを作成する。成熟マウスでDREADを刺激し筋線維芽細胞の出現を促進させた場合、心筋梗塞後にDREADを刺激し分化を抑制した場合、正常時にDREADを刺激した場合などの炎症応答や心機能を比較し、筋線維芽細胞への分化がどのようなシグナルにより制御されているのか明らかにする。健常時には筋線維芽細胞の分化を抑止する因子が周辺の細胞から分泌されるため、健常なマウスのDREADを刺激して生じた筋線維芽細胞は、刺激を中止すると速やかに筋線維芽細胞としての性質を失うと予想している。マイクロアレイや単離した細胞を用いて、分化に抑制的に働く因子を同定する。さらに、コラーゲンプロモーターにEGFPあるいはペリオスチンプロモーターにDsRedを付加したトランスジェニックマウスを作成する。得られたマウスに心筋梗塞処置を施し、EGFPあるいはDsRedを発現している細胞群を単離する。単離した細胞群の貪食能やサイトカインの産生能などを検討する。さらにマイクロアレイ解析を行い、2つの細胞群を特徴づける遺伝子を同定する。
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すべて 雑誌論文 (4件) (うち国際共著 1件、 査読あり 4件、 オープンアクセス 4件) 学会発表 (11件) (うち国際学会 3件、 招待講演 2件) 備考 (1件)
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http://chudoku.phar.kyushu-u.ac.jp/
