膵癌に対するiPS細胞由来樹状細胞による革新的ペプチドワクチン療法の臨床応用

2019 年度 実績報告書

• 研究課題/領域番号: 17H01580
• 研究機関: 和歌山県立医科大学
• 研究代表者: 山上 裕機 和歌山県立医科大学, 医学部, 教授 (20191190)
• 研究分担者: 尾島 敏康 和歌山県立医科大学, 医学部, 講師 (60448785) ; 北畑 裕司 和歌山県立医科大学, 医学部, 学内助教 (00535338) ; 川井 学 和歌山県立医科大学, 医学部, 准教授 (40398459) ; 岡田 健一 和歌山県立医科大学, 医学部, 講師 (50407988) ; 勝田 将裕 和歌山県立医科大学, 医学部, 准教授 (50464673) ; 廣野 誠子 和歌山県立医科大学, 医学部, 講師 (60468288) ; 宮澤 基樹 和歌山県立医科大学, 医学部, 講師 (90549734)
• 研究期間 (年度): 2017-04-01 – 2021-03-31
• キーワード: iPS細胞 / 樹状細胞 / 癌ワクチン / ペプチド / 臨床試験

研究実績の概要

令和元年度は昨年度に引き続きエピソーマル・プラスミド法で誘導したiPS-DCの抗腫瘍効果の解析を行った．KIF20A, MUC16, Mesothe lin, VEGFR1, R2発現プラスミドベクターを作成し，各蛋白の発現をFACSおよびウエスタンブロッティングで確認した．このベクターを健常人由来iPS-DCにエレクトロポレーション法で導入し，2日間培養した．刺激後のDCの表面マーカーCD80, CD83 , CD86, MHC-classI，classIIおよびCCR7, TLR2,4を確認したところ，刺激前と比較し，CD80 (75%が88%), CD86 (86%が98%), CCR7 (45%が62%)の発現増強をFACSにて確認した．続いて，刺激後iPS-DCをstimulatorとし，PBMCとin vitro刺激を3回行い，bulk CTLを誘導し，その後MACSにてCD8 CTLを誘導した．現在，メソテリン遺伝子導入LCLを疑似ターゲットとした細胞傷害活性をCrリリース法にて確認している．
また令和元年度は前臨床試験（iPS-DCの品質管理） を開始した．具体的には，細胞表面マーカーの解析；3x105個のカクテルペプチド刺激iPS-DCをflow cytometryを用いてisotype (1k, 2ak)およびCD86,HLA-DRを解析した。無菌試験；日本薬局方無菌試験法に従い、メンブレンフィルター法で液体チオグリコール酸培地・ソイビ ーン・カゼインダイジェスト培地を使用して、14日間培養して無菌性を担保した．現在，エンドトキシン測定およびマイコプラズマ否定試験を行っている．

現在までの達成度 (区分)

2: おおむね順調に進展している

理由

KIF20A, MUC16, Mesothe lin, VEGFR1, R2発現プラスミドベクターの作製に難渋した．各遺伝子の連結がうまくいかず，VEGFR1 R2遺伝子の導入が困難であった．試行錯誤のうえ，コザック配列をVEGFR1 R2遺伝子の上流に挿入することで、スムーズな蛋白発現が可能となった．その後のin vitro CTLの誘導は問題なく行えている．また令和元年度はiPS-DCの前臨床試験を開始した．本研究の臨床応用実現に向け，着実に研究は進んでいる．以上よりおおむね順調に進展しているとした．

今後の研究の推進方策

令和2年度は引き続き，カクテルペプチド刺激iPS-DCのメソテリン特異的な細胞傷害活性の測定を行う．健常人ドナー5名のiPS-DCがすでに誘導されており，またおのおののLCLの樹立も終了している．まずは，ドナーLCLにメソテリン遺伝子を導入した疑似の陽性ターゲット，またコントロールベクターにて作成したネガティブターゲットを利用し，in vitro CTLが，メソテリン特異的な細胞傷害活性を有することを確認する．その後，VEGFR1 R2遺伝子導入に伴う，腫瘍新生血管をターゲットとしたCTL assayを行う．必要に応じ，CTLクローンを誘導する予定である．LCLをターゲットとした研究が終了したら，腫瘍細胞株を用いた研究を行う．HLA A24陽性のドナー3名よりin vitro CTLを誘導し，同様にHLA A24陽性かつメソテリンを発現しているMIAPACA2, Pan01をターゲットとした細胞傷害活性誘導を試みる．
iPS-DCの前臨床試験に関しては，無菌試験；日本薬局方無菌試験法に従い、メンブレンフィルター法で液体チオグリコール酸培地・ソイビ ーン・カゼインダイジェスト培地を使用して、14日間培養して無菌性を担保する．エンドトキシン測定；日本薬局方エンドトキシン試験に従 い、検量線の信頼性確認試験を行う．エンドトキシンによる試薬の活性化に伴って形成されるゲルによる吸光度を測定する． マイコプラズマ否定試験；日本薬局方マイコプラズマ否定試験に従ってPCRで解析する．一般毒性試験（間歇投与試験）；用量段階は1用量 とし、げっ歯類1種のヌードマウスを20例で検討する。iPS-DC投与数は1x106個/kgで、皮内に3回間歇的に投与する．

研究成果

• [雑誌論文] Anticancer effects of chemokine-directed antigen delivery to a cross-presenting dendritic cell subset with immune checkpoint blockade. (2020)
  • 著者名/発表者名: Mizumoto Y, Hemmi H, Katsuda M, Miyazawa M, Kitahata Y, Miyamoto A, Nakamori M, Ojima T, Matsuda K, Nakamura M, Hayata K, Fukuda-Ohta Y, Sugiyama M, Ohta T, Orimo T, Okura S, Sasaki I, Tamada K, Yamaue H, Kaisho T.
  • 雑誌名: Br J Cancer. 巻: 122 ページ: 1185-1193.
  • DOI: 10.1038/s41416-020-0757-2.
  • 査読あり / オープンアクセス
• [雑誌論文] Deregulation of the Histone Lysine-Specific Demethylase 1 Is Involved in Human Hepatocellular Carcinoma. (2019)
  • 著者名/発表者名: Kim S, Bolatkan A, Kaneko S, Ikawa N, Asada K, Komatsu M, Hayami S, Ojima H, Abe N, Yamaue H, Hamamoto R.
  • 雑誌名: Biomolecules. 巻: 9 ページ: E810
  • DOI: 10.3390/biom9120810.
  • 査読あり / オープンアクセス
• [雑誌論文] eVIDENCE: a practical variant filtering for low-frequency variants detection in cell-free DNA. (2019)
  • 著者名/発表者名: Mizuno K, Akamatsu S, Sumiyoshi T, Wong JH, Fujita M, Maejima K, Nakano K, Ono A, Aikata H, Ueno M, Hayami S, Yamaue H, Chayama K, Inoue T, Ogawa O, Nakagawa H, Fujimoto A.
  • 雑誌名: Sci Rep. 巻: 9 ページ: 15017
  • DOI: 10.1038/s41598-019-51459-4.
  • 査読あり / オープンアクセス
• [雑誌論文] Loss of CEACAM1 is associated with poor prognosis and peritoneal dissemination of patients with gastric cancer. (2019)
  • 著者名/発表者名: Takeuchi A, Yokoyama S, Nakamori M, Nakamura M, Ojima T, Yamaguchi S, Mitani Y, Shively JE, Yamaue H.
  • 雑誌名: Sci Rep. 巻: 9 ページ: 12702
  • DOI: 10.1038/s41598-019-49230-w.
  • 査読あり / オープンアクセス
• [雑誌論文] Genomic analysis of pancreatic juice DNA assesses malignant risk of intraductal papillary mucinous neoplasm of pancreas. (2019)
  • 著者名/発表者名: Mateos RN, Nakagawa H, Hirono S, Takano S, Fukasawa M, Yanagisawa A, Yasukawa S, Maejima K, Oku-Sasaki A, Nakano K, Dutta M, Tanaka H, Miyano S, Enomoto N, Yamaue H, Nakai K, Fujita M.
  • 雑誌名: Cancer Med. 巻: 8 ページ: 4565-4573
  • DOI: 10.1002/cam4.2340.
  • 査読あり