研究課題
本研究提案では、ゲノムストレス応答においてTIP60ヒストンアセチル化酵素が、ポリADPリボシル化酵素PARP-1の活性を制御するという我々の知見をもとにTIP60とPARP-1の連携機構の解明を行うことを目的としている。これまでに明らかにした知見は、PARP-1の基質であるNADを合成する酵素NADSの損傷領域への誘導が、TIP60のアセチル化を介したH2AXの交換反応に依存していることを明らかにした。さらにTIP60によるアセチル化シグナルとNADSの局在をPLAシグナルとして検出することにも成功し、またNADSのノックダウン細胞においてH2AXの交換反応が、抑制されることも確認した。円順列変異蛍光蛋白質型バイオセンサーにおけるDNA損傷領域におけるNADの合成の検出は、現在進行中である。TIP60およびH2AX複合体のプロテオミクス解析の中でアセチル化を介したNADSの損傷領域への誘導に関与する因子の候補は、すでに幾つか捉えており、これら因子は、NADSがDNA損傷領域に誘導された後に、その領域でNADSを維持するために必要であることが明らかになりつつある。現在は、その点についてこれら因子のノックダウン細胞を用いて、クロマチン免疫沈降法とGFP-NADSの発現細胞を用いたmicro-irradiationで検証している。これらTIP60ヒストンアセチル化酵素とポリADPリボシル化酵素PARP-1の連携が、放射線感受性と如何なる関係にあるのかについては、高線量率の放射線障害においては、この連携の破綻した細胞では、感受性の増強が確認することができ、また本年度は、低線量率の放射線障害においても検討を加えており、成果が出始めている。これらの知見から線量率効果の分子レベルの理解が進むと考えている。
2: おおむね順調に進展している
既存のクロマチン免疫沈降法は、I-Sce1の認識配列を含んだカセットを細胞に導入した方法で行っていたが、このカセットは、DR-GFPのシステムであり、GFP発現の際に使われるプロモーターにTIP60が、作用する可能性がある。こういった可能性を除外するために今回は、より生理的な状況下で検証できるCRISPR-Cas9の方法でDNA二本鎖切断を誘導するシステムに切り替えた。この方法においてもNADSのDNA二本鎖切断領域への集積を確認することができた。今後は、この新たに立ち上げたクロマチン免疫沈降法で実験を行う予定である。またTIP60によるアセチル化シグナルとNADSの局在をPLAシグナルとして検出することにも成功し、さらにNADSのノックダウン細胞においてH2AXの交換反応が、抑制されることも確認した。円順列変異蛍光蛋白質型バイオセンサーにおけるDNA損傷領域におけるNADの合成の検出は、現在進行中であり、この点が、昨年から持ち越しであるが、実験は問題なく進んでいると判断している。また線量率効果におけるTIP60とPARP-1の連携機構の役割とその意義についても知見が得られつつある。以上により、概ね研究は、順調に展開されていると判断できる。
NADの合成酵素であるNADSが、TIP60によるアセチル化に依存してDNA損傷領域に局在することは、検証できたので、今後は、実際にNADが、DNA損傷部位で産生されることを実証する必要がある。そのために昨年度からの持ち越しである、円順列変異蛍光蛋白質型バイオセンサーにおけるDNA損傷領域におけるNADの合成の検出を引き続き行う予定である。本年度は、この実験に加えてdCasのシステムを用いてDNA損傷部位にGFP-NADSを誘導するシステムを構築して、CRISPR-Cas9を用いた新たなクロマチン免疫沈降法で損傷部でのアセチル化の状態を検証する。具体的には、ヒストンH4のhyperacetylationについて、H4K16のアセチル化抗体、H4のアセチル化全体を認識するpentaH4アセチル化抗体を用いて検証を行う予定である。これらの知見をもとにアセチル化とNADSとの関係が、feedback制御になっているのか否かについて明らかにする。また放射線感受性については、これまで高線量率での検証に止まっていたが、本年度は、低線量率でのアセチル化とポリADPリボシル化との連携機構の役割も明らかにし、線量率効果のクロマチン制御に基づいた分子レベルでの理解にも貢献していく予定である。
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すべて 雑誌論文 (2件) (うち査読あり 2件、 オープンアクセス 2件) 学会発表 (7件) (うち招待講演 4件)
elife
巻: 7 ページ: e32222
10.7554/eLife.32222.
Nucleic Acids Res
巻: 46 ページ: 10007-10018
10.1093/nar/gky661.
