| 研究課題/領域番号 |
17H01881
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| 研究機関 | 九州大学 |
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研究代表者 |
松島 綾美 九州大学, 理学研究院, 准教授 (60404050)
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| 研究期間 (年度) |
2017-04-01 – 2020-03-31
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| キーワード | 発現制御 / 生体分子 / 生理活性 / 受容体化学 / 分子認識 / 人体有害物質 |
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| 研究実績の概要 |
ビスフェノールＡ（BPA）は、ポリカーボネート・プラスチックの原料として世界最大規模の生産量を誇る化学物質である。一方で、プラスチックから漏出した低用量のBPAが、特に胎児・乳幼児の脳神経系へ悪影響を及ぼすと強く懸念される内分泌撹乱物質でもある。申請者らは、エストロゲン受容体α(ERα)に対する弱いBPAの活性が、ERRγが存在すると増強される特異な現象を見い出した。そして、これがBPA低用量作用発現の根源であると考えるに至った。本研究の目的は、この発見に基づき、低用量作用の分子機構の本質を、生化学的および構造解析学的手法で解明することである。
初年度である本年度は、次世代シークエンサーを用いた網羅的塩基配列解析である先進ゲノム支援に申請したが、惜しくも採択がなかった。そこで、次年度の採択を目指し、前倒しして化合物暴露のマウス脳の準備に取り掛かり、現在も行動観察を継続中である。さらに、ERαとERβの領域欠損型受容体を作成した。加えて、ERαとERβのキメラ受容体も作成した。これらの６種について、レポーター遺伝子アッセイにより転写活性を評価した。その結果、リガンド結合部位のみならず他の領域でもリガンド依存的に転写活性に影響することが示唆された。ERRについては、当初計画に加えて、ERRα、ERRβ、ERRγの全てについて、ERαとの相互作用解析を実施することにした。現在、ERα、ERβ、ERRα、ERRβ、ERRγについて、レポーター遺伝子アッセイによる転写活性評価に加え、哺乳類培養細胞を用いたtwo-hybrid試験を実施中である。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
2: おおむね順調に進展している
理由
３年計画の初年度である本課題研究は、概ね計画通り順調に進展している。今年度は次世代シークエンサーを用いた網羅的塩基配列解析のために、申請計画通りに先進ゲノム支援に申請した。これは本年度の採択には至らなかった。そこで、採択後にすぐに資料を提供できるよう、前倒して化合物暴露による実験動物の行動解析を実施中である。
研究実施計画どおりにERおよびERRの領域欠損型受容体の作製と活性試験とERαとERβのキメラ受容体の作製と活性試験を実施した。ERαとERβのキメラ受容体に加えて、ドメイン欠損型の受容体の実験結果より、予想外の領域も相互作用すると考えられるという重要な知見も得られるなど、貴重な実験データが蓄積できた。そこで、追加で哺乳類培養細胞を用いたtwo-hybrid試験を実施し、詳細実験を実施しようとしているところである。また、当初計画通り遺伝子応答配列を繋ぐDNA応答配列を繋ぐスペーサー間隔の効果を解明するため、この領域の長さを変えたレポータープラスミドを作成し、その転写活性を評価した。その結果、当初の予想通りに最適な長さが存在することが判明した。現在の研究状況としては、ERRαとERRγの場合における最適な長さの違いは何が原因なのかなど、得られた結果に基づいて、立体的な位置関係を推定しているところである。
このように本研究はほぼ計画通りに推移しており、当初計画を順調に達成している。
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| 今後の研究の推進方策 |
今後は、まず、引き続き平成30年度に再度先進ゲノム支援に研究支援を申請し、化合物を曝露したマウス脳における遺伝子発現の変動をシークエンサーを用いた網羅的塩基配列解析により解明することを目指す。さらに、本年度は、初年度で得られたERαとERβ及び、ERαとERRα、ERRβ、ERRγのキメラ受容体の活性を評価に基づき、これらで検出された活性の差が、ドメイン間の直接あるいは間接の相互作用によるものなのか、別の構造要因によるものなのかを明らかにする。そのために、ERとERRの機能ドメイン別の相互作用解析について、それが直接の相互作用なのか、否かを、発現タンパク質を用いてBiacoreで解析する。さらに、細胞核内で相互作用が起こるのかを、Proximity Ligation Assay（PLA）法を用いた細胞内相互作用で解析する。現時点では、ERとERRは直接に近位で相互作用するのか、あるいは複合体の一部として遠位に存在しているのか不明である。そこで、内在性タンパク質の相互作用や局在を細胞内のその場で検出できるin situ PLA法により、ERとERRが直接相互作用するのか、それとも介在因子があり遠位に位置するのかを明らかにすることができる。これらに加え、脳神経系細胞におけるBPA暴露による協働作用の同定と標的遺伝子の解明を目指して、神経細胞モデルとして用いられるPC12細胞や、ヒト神経芽細胞腫由来のSH-SY5Y細胞において、BPA暴露による低用量効果を調べる。
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