| 研究課題/領域番号 |
17H02083
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| 研究機関 | 京都大学 |
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研究代表者 |
亀井 謙一郎 京都大学, 高等研究院, 准教授 (00588262)
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| 研究分担者 |
田畑 修 京都大学, 工学研究科, 教授 (20288624)
平井 義和 京都大学, 工学研究科, 助教 (40452271)
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| 研究期間 (年度) |
2017-04-01 – 2020-03-31
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| キーワード | 幹細胞 / マイクロ流体デバイス / オルガノイド / 血管網 / 肝臓 |
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| 研究実績の概要 |
本研究の目的は、機能的な「立体組織構造体(オルガノイド)」を高効率に再現性良く作製できる方法を開発し、かつ再生医療や創薬に有用な組織形成のメカニ ズムを解明することである。従来のマクロなオルガノイド作製法は細胞の自発的な凝集に依存し、再現性が低いことが問題であった。これは組織形成に適した化学的・物理的な環境が厳密かつ任意に創出できないためである。そこで本研究では、これらの化学的・物理的な環境因子を時・空間的に制御可能なマイクロ流体3 次元細胞培養デバイスを開発し、再現性の高いオルガノイド作製法を提案する。Proof-of-Conceptとして、従来のオルガノイド作製法では機能発現が困難であり 再現性も低かった肝臓に着目し、本研究で提唱する新規作製法で、これらの問題点を解決し、肝臓の発生機構を解明する。 当該年度では、オルガノイドを作製するために、
1. 物理的刺激を可能にするマイクロ流体デバイスの開発を行った。その結果、幹細胞由来の肝臓細胞に物理的刺激（熱・機械的刺激）を印加し、機能的に向上していることが観察できた。当該年度では、特にCYP3A4の発現と活性が向上していることを同定できた。
2. iPS細胞から肝臓細胞への分化誘導・オルガノイド形成を行う最適化条件を試験しているところである。これまでのオルガノイドは血管網がないことが欠点とされており、それが機能不全にも結びついていた。本研究ではiPS細胞だけでなく血管内皮細胞だけでなく、間葉系幹細胞や星細胞など他の細胞を混入することによって、血管網を装備したオルガノイ ド形成を行う。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
1: 当初の計画以上に進展している
理由
本年度では、生体内の肝臓における細胞配置を再現するために、マイクロメートルスケールでの3次元細胞配置法をマイクロFD技術を応用して確立する。 肝機能を発揮する組織単位として肝小葉構造に着目し、細胞培養チャンバはそれを模する構造で設計する。また、そのチャンバに必要に応じた細胞を個別に導入 できるように、細胞ごとに対応したマイクロ流路と内臓バルブを設置する。細胞には、肝組織に必要な肝実質細胞・血管内皮細胞・間葉系幹細胞・胆管細胞・ クッパー細胞などを用いる。 本研究で作製するFDは、共同研究者(田畑、平井)が開発した3次元ソフトリソグラフィを用いる。この方法はソフトリソグラフィという加工技術に数値解析技術 を組み合わせた全く新しい概念の加工技術を構築することで、従来のリフローなどの微細加工技術では不可能であった複雑な3次元構造を容易に精度良く作製でき る。デバイス材料としては、生体適合性・ガス透過性・光透過性が非常に高いpolydimethylsiloxane (PDMS)を使用する。 肝臓組織を再現するために、その構造を模倣した細胞培養チャンバと内臓バルブを搭載するFDを開発する。当該年度では、3種類の細胞（ヒト多能性幹細胞由来肝実質細胞、間葉系幹細胞、血管内皮細胞)を混入することで、血管網を保持する肝臓オルガノイドの作成に成功した。また組織構造を確認するために、非破砕実験法を用いて機能タンパク質タンパク質の発現確認にも成功している。また組織機能は、タンパク質生産能、薬物取り込み・放出能、薬物代謝などより多角的に評価を行っており、現在、いくつかの評価系では機能向上を確認できている。
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| 今後の研究の推進方策 |
3種類の細胞を用いてオルガノイド作製を行ったが、本年度では更に肝臓組織の高度な再現を目指す。近年、組織形成における免疫反応の重要性が着目されている。そこで肝臓内の免疫細胞であるクッパー細胞や肝星細胞を加えてオルガノイドを作成し、より高機能なオルガノイド作成法の開発を目指す。 また、肝臓オルガノイド形成における物理的・化学的な環境因子の作用機構について明らかにする。特に複数の環境因子を印加した場合、それらの因子が活性化 するシグナル伝達のクロストークによって、組織形成におけるシナジー効果の有無を明らかにする。特に昨年度は、複数の物理的因子が肝臓機能の向上に有用であることが示せており、本年度では、条件の最適化とメカニズム解析を行う。また、各環境因子による細胞内シグナル伝達や遺伝子発現機構を解明するために、各シグナル阻害剤・ 活性剤、siRNAなどをオルガノイド形成中に添加しオルガノイド形成における変化を観察、組織形成に最も重要なシグナル伝達や遺伝子発現経路を同定する。
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